實時熒光定量RT_PCR檢測肝癌_省略__122a及miR_224的表達_劉卓然

1、2009;29(4)南方醫(yī)科大學學報(JSouthMedUniv)·751·實時熒光定量RT-PCR檢測肝癌組織中miR-122a及miR-224的表達劉卓然1，陳小衛(wèi)2，喬新惠2，王蓉3，向征4(南華大學1附屬第二醫(yī)院檢驗科，2生命科學與技術(shù)學院生物技術(shù)系，3附屬第一醫(yī)院血液科，湖南衡陽421001；4暨南大學分子免疫學和抗體工程研究中心，廣東廣州510632)摘要：目的運用實時熒光定量RT-PCR方法分析miR-122與miR-224兩種miRNAs在原發(fā)性肝細胞癌（HCC）中的采用基于2（-CT）的實時熒光定量RT-PCR法表達，探討以miRNAs為靶點在早期肝癌中的

2、臨床診斷意義。方法對35例肝癌組織及癌旁組織的miR-122a及miR-224進行了定量分析，結(jié)果經(jīng)由Northernblot驗證。結(jié)果與正常組織相比，在所有的被檢肝癌組織中，均發(fā)現(xiàn)了miR-122a有不同程度的表達下調(diào)(P<0.01)，而上述肝癌組織中的miR-224的定量結(jié)果顯示該miRNA表達顯著增加(P<0.001)。結(jié)論HCC組織中存在上述兩種miRNAs表達水平的改變，實時熒光定量RT-PCR法為早期、準確的在臨床上檢測肝組織癌變提供了新的思路。關(guān)鍵詞：miR-122；miR-224；實時熒光定量RT-PCR；肝癌中圖分類號：R730.43文獻標識碼：A文章編號：167

3、3-4254(2009)04-0751-03DetectionofmiR-122aandmiR-224expressioninhepatocellularcarcinomabyreal-timefluorescencequantitiveRT-PCRLIUZhuo-ran1,CHENXiao-wei2,QIAOXin-hui2,WANGRong3,XIANGZheng413DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,2DepartmentofBiotechnology,SchoolofLifeScienceandTechnol

4、ogy,DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;4MolecularImmunologyandAntibodyEngineeringCenter,JinanUniversity,Guangzhou510632,ChinaAbstract:ObjectiveTodetecttheexpressionsofmiR-122andmiR-224inhepatocellularcarcinoma(HCC)byreal-timefluorescencequantit

5、ativeRT-PCRandinvestigatethesignificanceofmiRNAsinearlydiagnosisofHCC.Methods2-CTmethodwasusedforquantitativeanalysisoftheexpressionpatternofmiR-122andmiR-224in35HCCandadjacentnormaltissues.AllthequantitativeresultswereconfirmedbyNorthernblotting.ResultsComparedwithadjacentnormaltissues,theHCCtissue

6、sshowedsignificantmiR-122down-regulation(P<0.01)andmiR-224over-expression(P<0.001).ConclusionHCChasobviousalterationintheexpressionpatternsofmiR-122andmiR-224,andreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRprovideanewmeansforearly,efficient,andaccuratediagnosisofHCC.Keywords:miR-122;miR-224;real-ti

7、mefluorescencequantitativeRT-PCR;hepatocellularcarcinoma肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是目前臨床上位列第三的惡性腫瘤。我國是肝癌高發(fā)區(qū)之一。肝癌最主要的病因有病毒感染所致（HBV和HCV）、非病毒因素（酒精及食物中黃曲霉毒素B1攝入）以及遺傳性肝病肝硬化等1。目前，肝癌的發(fā)病機制還不是十分清楚?；谌藗兤毡檎J為抑癌基因的異常失活或癌基因的激活是導致肝癌發(fā)生的主要原因，近年來，研究發(fā)現(xiàn)micoRNAs(miRNAs)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起到非常重要的作用2。大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后而生

8、成。生物體內(nèi)的miRNA對其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)節(jié)起到非常重要的作用，它們能通過與靶mRNA3'端非編碼區(qū)序列的特異性結(jié)合從而啟動mRNA的降解同時抑制mRNA翻譯的進行2。miRNA現(xiàn)已被證實在不同的生理過程，諸如發(fā)育、分化、增值、凋亡及病毒感染中發(fā)揮著重要的作用3-4。最新的研究表明，有部分miRNA與腫瘤的關(guān)系密切。有些腫瘤組織特異性的miRNA亦被證實在腫瘤的發(fā)生過程中起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用5-7。同時，通過對不同類型肝癌組織的miRNA表達的分析，Zucman-Rossi等8得到了與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA的表達譜。本實驗結(jié)合相關(guān)文獻所報道的肝癌組織miRNA表達數(shù)據(jù)，

9、結(jié)合基于Delta-deltaCT的實時熒光定量PCR法對miRNA是一組小的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNAs(22nt)，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約7090個堿基收稿日期：2008-07-16基金項目：湖南省科技計劃項目(2008SK3072)；湖南省教育廳科學基金(08C732)作者簡介：劉卓然(1964-)，男，副主任技師，電話35例肝癌組織的miR-122a及miR-224進行了定量分析，以期建立一種臨床上可行的快速，準確的早期E-mail:LZr9656·752·南方醫(yī)科大學學報(JSouthMedUniv)第29卷肝癌診斷方法。cDNA的合成

10、采用miScriptReverseTranscriptionKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)依據(jù)操作說明進行，每一合成反應體系中包含約1g的總RNA，1lmiScriptReverseTranscriptase混合物，以及4lmiScriptRT反應緩沖液，37水浴1h反應完全。實時熒光定量PCR反應選用Qiagen公司的miScriptSYBRGreenPCRKitmiRNA定量擴增反應體系，反應總體積為25l，其中含有12.5l2×1材料和方法1.1標本來源南華大學附屬第二醫(yī)院肝膽腸外科2007年3月2008年3月間外科手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織標本35

11、例。其中男16例、女19例。年齡（50.5±8.30）（3165）歲，診斷依據(jù)肝穿刺活體組織檢查、CT、MRI及AFP等確診。所有標本均經(jīng)過病理學證實?；颊咝g(shù)中、術(shù)前均未經(jīng)放、化療及免疫治療。另取上述HCC患者的癌旁肝組織作為對照。手術(shù)切除的新鮮標本立即放入液氮中凍存并于-80冰箱保存。QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix，2l反轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物，2.5l10×misScriptUniversalPrimer，2.5l檢測特異miRNA引物，引物序列參考文獻9引物序列見表1。最后用ddH2O補足體系至25l。實時PCR反應條件：95預變性8min；然后

12、以9315s、5530s和7230s進行40個循環(huán)。擴增反應在實時熒光定量PCR儀Rotor-Gene3000儀上進行。在擴增待測miRNAs的同時，我們還擴增了U61.2RNA提取采用Trizol法提取組織總RNA，將約2mm3冷凍肝臟組織在液氮中研磨，將組織懸液按照RecoverAllTMTotalNucleicAcidIsolationKit(Ambion,Austin,TX)的操作說明提取總RNA。紫外分光光度計NanoDropND-1000(NanoDrop,Wilmington,DE)用于評估RNA的濃度和純度。所有RNA樣品置-80保存?zhèn)溆谩?.3miRNAs反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量

13、RT-PCRRNA作為內(nèi)對照，待測miRNAs的量通過2（-CT）法確定，CT=(CTmiRNA-CTU6RNA)待測樣品-(CTmiRNA-CTU6RNA)對照組。對照組樣品取自每位患者正常的癌旁組織，經(jīng)病理學證實，實時PCR反應結(jié)果為3次獨立實驗的校正結(jié)果。表1miR-122miR-224的成熟miRNA序列及引物序列Tab.1MaturemiRNAsequencesandreal-timePCRprimersformiR-122andmiR-224miRNAmiR-122amiR-224U6RNAMirBase#MIMAT0000421MIMAT0000281NCBI:X07425.1m

14、iRNAsequence(s)UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUACACCACGUUUAUACGCCGGUGRT-PCRprimersequence(s)TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTACACCACGTTTATACGCCGGTG1.4Northernblot檢測miRNAs的表達取RNA樣品約15g，15%丙烯酰胺（含7mol/L尿素）凝膠電泳分離，于半干電轉(zhuǎn)儀上以100mA轉(zhuǎn)移2h，轉(zhuǎn)膜至HybondN+membrane(AmershamBiosciences)。紫外交聯(lián)儀上用

15、紫外線交聯(lián)125mJ，最后于80干烤1h。37預雜交2h。加入5'端用-32PATP標記的探針，37雜交過夜，用2×標準磷酸鹽溶液（含0.18mol/LNaCl和10我們所選擇的兩種腫瘤標志miRNAs在反應體系中都能有效的擴增，如圖一所示，依據(jù)CT值間的比較，通過2（-CT）法分別計算每一被檢肝癌組織樣品中兩種miRNAs相對正常癌旁組織的表達變化比率。對所得到的每一組織miRNA變化比率取平均值（n=35），用以評估所選miRNA在肝癌癌變過程中的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)，在所有的肝癌組織中，mmol/L磷酸鹽，pH7.4)42洗膜兩次，放射自顯影。用以雜交的兩條探針序列分別為

16、：miR-122a，5'-ACAAACACCATTGTCACACTCCA-3'；miR-224，5'-TAAACGGAACCACTAGTGACTTG-3'10。每次檢測同時雜交U6RNA作內(nèi)對照，探針序列：5'-GCAGGGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCG-3'。2結(jié)果2.1實時熒光定量檢測miR-122a和miRNA-224在肝癌組織中的表達miRNA-122a都出現(xiàn)下調(diào)，降低比值為-2.38±0.89（P<0.01），miRNA-224的表達均有顯著提高，升高比值為20.32±3.65(P<0.

17、001)。2.2Northernblot檢測結(jié)果兩種miRNAs以及種U6RNA的相對含量如圖2所示，miRNA-224在正常組織的表達量非常小，但是在肝癌組織，實驗結(jié)果顯示miRNA-224的表達非常明顯。反之，相對正常組織而言，腫瘤組織中miRNA-122a的表達量顯著降低。3討論第4期劉卓然,等.實時熒光定量RT-PCR檢測肝癌組織中miR-122a及miR-224的表達·753·0.8NormFluoro0510152025Cycle30354045NTC0.20NormFluoroNTC510152025Cycle3035404

18、5圖1實時熒光定量PCR檢測miRNAs的擴增曲線Fig.1RepresentativeamplificationcurveofmiRNAsinHCCandtheadjacentnormaltissuesA:TheamplificationofU6RNAandmiR-122a.1,2:RT-PCRresultsofU6RNA;3,4:RT-PCRresultsofmiR-122a.2and4werefromthesamepatientwithHCC,and1and3werefromthesameadjacentnormaltissue.B:TheamplificationofU6RNAandm

19、iR-224.5,6:RT-PCRresultsofU6RNA;7,8:RT-PCRresultsofmiR-122a.5and7werefromthesamepatientwithHCC,and6and8werefromthesameadjacentnormaltissue.NTC:No-templatecontrol.Allamplificationswererepeatedfor3times.mir-122a織、細胞以及實驗模型中miRNAs的表達譜14-16，多方面的研究數(shù)據(jù)表明，肝臟組織特異性的miRNAs在一些惡性肝組織或細胞中的表達量相對正常組織或細胞有非常明顯的變化，諸如，mi

20、R-224、miR-21、U6RNAHCCmir-244NormalmiR-34a、miR-221/222、miR-122a以及miR-145。肝癌組織的miRNAs表達譜數(shù)據(jù)提示我們，在臨床上對肝癌的診斷、分級，miRNA無疑是一種全新的且非常有效的標志物。尤其對于臨床診斷來說，越早期的確診意味著更有效的治療。目前，國內(nèi)外對于miRNA用于臨床肝癌診斷的報導較少，且實時熒光定量RT-PCR尚未運用于臨床上對癌癥組織特異性miRNA的表達進行診斷。實時熒光定量方法是一種準確的、重現(xiàn)性好、高效、值得信賴的科學方法，而且在miRNA的定量上有著MiroU6RNA圖2miR-122a和miR-224

21、a在肝癌組織中的表達，U6RNA作為內(nèi)參Fig.2RepresentativeresultsofNorthernblottingofmiRNAsmiR122aandmiR-224confirmingmir-122adown-regulationandmiR-224up-regulationinHCCusingU6RNAasthecontrolarray和Northernblotting無法比擬的優(yōu)勢17，在我們的研究中，我們挑選了兩種非常有代表性的肝臟組織特異的miRNAs，miR-122a和miR-224結(jié)合一定數(shù)量的臨床腫瘤組織標本，并選用實時熒光RT-PCR作為檢測手段，建立了一種可以日

22、后在臨床上運用的檢測平臺，相對傳統(tǒng)的DNA水平以及mRNA水平的診斷方式而言，在時間上miRNAs能夠更早期的提示癌變。同時，我們的結(jié)果亦經(jīng)Northernblot驗證，結(jié)果可靠。因此，我們的研究為今后在臨床上展開新的更高效的肝癌診斷方法提供了一定的實驗依據(jù)。參考文獻：1Laurent-PuigP,Zucman-RossiJ.GeneticsofhepatocellulartumorsJ.Oncogene,2006,25(27):3778-86.2miRNAs是一類近些年所發(fā)現(xiàn)的對基因表達調(diào)控具有非常重要的調(diào)節(jié)作用的小分子RNA11，通常，miRNAs基因位于基因的內(nèi)含子區(qū)段，有時在一些非編碼

23、的基因的外顯子以及基因間區(qū)域亦有miRNAs基因的分布。在動物細胞中，miRNA基因的轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物很快被一種核糖核酸酶Drosha加工成為miRNA前體(pre-miRNA)，然后由細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，經(jīng)另一種核糖核酸酶Dicer識別剪切為成熟miRNA12。近些年來人們對癌癥以及小分子RNA進行了廣泛的研究，人們發(fā)現(xiàn)許多位于人類基因組的一些相對脆弱區(qū)域(fragileregions)的miRNA通過對其相應靶基因的功能調(diào)控在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到了非常重要的作用13。近兩年內(nèi)，國外幾個實驗室先后報導了在肝癌組BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mec

24、hanism,andfunctionJ.Cell,2004,116(2):281-97.（下轉(zhuǎn)756頁）·756·南方醫(yī)科大學學報(JSouthMedUniv)第29卷NCCN指南要求直腸癌至少需要清掃12枚以上的淋巴結(jié)，本病例組為（7.08±6.5）枚，這可能歸因于經(jīng)過CRT的患者術(shù)后淋巴結(jié)數(shù)目會顯著減少，這在2008版NCCN指南中也明確指出。我們體會到，接受了CRT的患者術(shù)中探查確實存在盆腔臟器水腫或粘連，但得益于腔鏡下良好的顯露、放大的視野能提供一個清晰的解剖層次，超聲刀的正確使用能明顯的減少出血從而保證術(shù)野的清潔，避免手術(shù)的誤傷，從而保證手術(shù)安全可行。本

25、研究未作術(shù)后長期隨訪，故腹腔鏡聯(lián)合CRT治療后局部復發(fā)率及遠處轉(zhuǎn)移率還待進一步研究。本研究初步論證了腹腔鏡聯(lián)合CRT在中低位直腸癌應用中是安全、可行的。參考文獻：1郁寶銘,張敏,吳唯勤,等.新輔助放化療在局部進展期低位直腸癌中的療效J.中華外科雜志,2007,45(7):445-8.2董功航,蘭平,汪建平.中低位直腸癌術(shù)前放化療現(xiàn)狀J.中華實用外科雜志,2008,28(2):149-50.3MoserL,RitzJP,HinkelbeinW,etal.AdjuvantandneoadjuvantonopenquestionsJ.IntJColorectalDis,2008,23(3):227-

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