抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定及對(duì)PBMC增殖反應(yīng)的影響

1、    抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定及對(duì)PBMC增殖反應(yīng)的影響        摘要目的對(duì)已構(gòu)建表達(dá)的抗CD4人-鼠嵌合抗體的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，比較嵌合抗體與鼠源性單抗對(duì)抗CD3McAb和EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）增殖反應(yīng)的影響，以探討抗CD4抗體的增殖抑制作用機(jī)制。方法采用間接免疫熒光競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)比較兩種抗體對(duì)CD4抗原的相對(duì)親和力，MTT法檢測(cè)抗CD4抗體的增殖抑制作用。結(jié)果轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定表達(dá)及分泌特異性抗CD4人-鼠嵌合抗體的能力；兩種抗體對(duì)C

2、D4抗原的相對(duì)親和力相同；對(duì)經(jīng)TCR途徑刺激誘導(dǎo)的PBMC增殖反應(yīng)均有抑制作用，嵌合抗體的增殖抑制作用較鼠源性單抗強(qiáng)。結(jié)論抗CD4抗體的抑制作用很大程度上直接作用于TCR誘導(dǎo)的活化信號(hào)。關(guān)鍵詞人-鼠嵌合抗體；相對(duì)親和力；增殖抑制效應(yīng)中分類號(hào)R392.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-8861（2000）04-0265-03 Identification of anti-CD4 chimeric antibody and detection of    its effects on PBMC proliferationZHANG Zhi-hong，SHEN Guan-xin

3、，YANG Jing，ZHU Hui-fen，ZHANG Yue（Department of Immunology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）Abstract Objective  To explore the mechanism of the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） proliferation，we identified the biological characte

4、ristic of the anti-CD4 humanmurine chimeric antibody，and compared their effects of the chimeric antibody with murine McAb on PBMC proliferation induced by anti-CD3 McAb or EBV transformed cellMethods  Using indirect immunofluorescence competed inhibiting experiment to compare two kinds of anti-

5、CD4 antibodies on relative affinity，and to detect the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on PBMC proliferation with MTT testResults  Transfectoma has the ability to express and secrete specific anit-CD4 Humanmurine chimeric antibody stablyChimeric antibody has the same relative affinity as

6、 murine McAbBoth the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb could inhibit PBMC proliferation induced by TCR approach，and chimeric antibody has better inhibitory effects than murine McAbConclusion  Most important inhibitory effects of the anti-CD4 antibody appeared to direct at TCR-induced a

7、ctivation signalsKey words Humanmurine chimeric antibody； relative affinity； inhibitory effects on proliferationCD4T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要作用1，抗CD4抗體可通過(guò)不同途徑阻斷CD4T細(xì)胞的功能，調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。抗CD4抗體在自身免疫性疾病治療和抗移植排斥反應(yīng)中具有極大的潛力2，3。目前國(guó)內(nèi)抗CD4抗體均為鼠源性，用基因工程技術(shù)對(duì)鼠源性單抗進(jìn)行改造，構(gòu)建人-鼠嵌合抗體，既可保持鼠源性單抗的特異性，又降低了對(duì)人體的免疫原性。因此，將治療性鼠源性單抗轉(zhuǎn)變成人-鼠嵌合抗體具有

8、很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。為此我們對(duì)已構(gòu)建表達(dá)的抗CD4人-鼠嵌合抗體的生物學(xué)特性進(jìn)一步進(jìn)行了鑒定，并比較嵌合抗體與鼠源性單抗對(duì)刺激原誘導(dǎo)的PBMC增殖抑制作用。1材料與方法1.1細(xì)胞株和細(xì)胞系分泌鼠源性抗人CD4單克隆抗體（MCA3）及抗人CD3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，均從ATCC公司引進(jìn)；分泌抗人CD4人-鼠嵌合抗體D4.9的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞株由本室構(gòu)建4；EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞由本教研室吳雄文副教授課題組制備；T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系（CEM），由德國(guó)埃爾蘭根大學(xué)臨床免疫研究所引進(jìn)。1.2主要試劑MTT為Sigma產(chǎn)品；絲裂霉素C為KgowaHakkoKogyoCo，Ltd產(chǎn)品；FITC標(biāo)記羊抗人IgG為上

9、海生物制品研究所產(chǎn)品；鼠抗人鏈單克隆抗體為Sigma產(chǎn)品；羊抗人IgG、羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG為華美公司產(chǎn)品。1.3腹水型抗體的制備及純化5采用辛酸提取法對(duì)兩種腹水型抗CD4抗體進(jìn)行純化，用U-200型紫外分光光度儀分別測(cè)其OD260和OD280值，根據(jù)公試計(jì)算IgG濃度6：IgG濃度（mgml）（145×OD2800.74×OD260）×稀釋倍數(shù)1.4抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定采用交叉夾心ELISA法鑒定轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞分泌抗體的Ig類型；以PBMC或CEM細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用間接免疫熒光法鑒定抗體的特異性。1.5相對(duì)親和力的測(cè)定用間接免疫熒光法，經(jīng)

10、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)CEM細(xì)胞表達(dá)CD4抗原的陽(yáng)性率，分別檢測(cè)純化的抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗與CEM細(xì)胞結(jié)合的飽和抗體濃度。用間接免疫熒光競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗CD4嵌合抗體和鼠源性單抗對(duì)CD4抗原的相互競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。1.6PBMC增殖實(shí)驗(yàn)取一個(gè)單位健康人除紅細(xì)胞的抗凝血（200ml），通過(guò)密度梯度離心常規(guī)分離獲得PBMC。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100l2×106mlPBMC懸液，然后分別加入不同濃度的抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗（終濃度為0.1、1、10、100gml），均設(shè)3復(fù)孔，設(shè)加入非特異性人IgG作為陰性對(duì)照，振蕩混合后，置4°C孵育1h，分別加入抗CD3 Mc

11、Ab（雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液）或絲裂霉素C（終濃度為25 gml）處理后的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞（1×106ml），置37°C、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加10lMTT（5mgml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，2 000rmin離心5min，去上清，每孔加入100l DMSO，振蕩5min后，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm的OD值，記錄結(jié)果。根據(jù)公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組抗CD4抗體的增殖抑制率：1.7數(shù)據(jù)處理各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組資料分析應(yīng)用二組均數(shù)t檢驗(yàn)其差異的顯著性。2結(jié)果2.1抗CD4嵌合抗體的特異性ELISA試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞分泌的抗體

12、能與抗人抗體和抗人輕鏈抗體反應(yīng)，不與抗鼠抗體反應(yīng)，從而證明此轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞株分泌的抗體為含有人的恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)的抗體。采用間接免疫熒光法證明，轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞分泌的抗體，與人PBMC反應(yīng)的陽(yáng)性率為3540，與CEM細(xì)胞均呈陽(yáng)性免疫熒光反應(yīng)。其熒光強(qiáng)度與鼠源性CD4單抗相似，而與CD4抗原陰性的Raji細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。2.2抗體相對(duì)親和力的測(cè)定CEM細(xì)胞為CD4抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明陽(yáng)性率為96.49，純化的抗CD4嵌合抗體和鼠源性抗CD4單抗與2×105CEM細(xì)胞結(jié)合的飽和抗體濃度均為10gml。采用間接免疫熒光競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)將抗CD4嵌合抗體以每毫升0、0.1、1、

13、10和100g分別與2×105CEM細(xì)胞作用后，鼠源性抗CD4單抗熒光染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也逐漸減少，分別為95.43、89.93、51.20、17.87、11.93。當(dāng)將鼠源性CD4單抗以每毫升0、0.1、1、10和100g分別與2×105CEM細(xì)胞作用后，抗CD4人-鼠嵌合抗體熒光染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也逐漸減少，分別為96.49、90.92、49.98、16.92、6.54。2.3抗CD4抗體的增殖抑制效應(yīng)抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗對(duì)抗CD3 McAb（見(jiàn)表1）或EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞（見(jiàn)表2）誘導(dǎo)的PBMC增殖均有

14、抑制作用。當(dāng)抗CD4嵌合抗體濃度為0.1gml時(shí)對(duì)PBMC增殖已有抑制作用。當(dāng)抗體濃度達(dá)10gml時(shí)，抑制作用明顯增強(qiáng)。當(dāng)繼續(xù)增加抗體濃度時(shí)，未見(jiàn)抑制效應(yīng)隨著抗體濃度的增加而增強(qiáng)。表明當(dāng)抗體濃度達(dá)10gml時(shí)即達(dá)最大抑制效應(yīng)濃度?？笴D4嵌合抗體對(duì)幾種刺激物誘導(dǎo)的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于鼠源性單抗。表1抗CD4嵌合抗體及鼠源性單抗對(duì)抗CD3 McAb誘導(dǎo)PBMC增殖反應(yīng)的抑制作用Tab1Theinhibitoryeffectsoftheanti-CD4chimericantibodyandmurineMcAbonanti-CD3inducedPBMCproliferationconcentrati

15、onofantibody（gml）chimericantibodymurineMcAbn±sn±s050500.1510.5±73*5630±37105299±99*510.3±67*105520±138*530.5±87*1005580±10.7*5321±98*P0.05，*P0.01，comparedwithcontrolgroup 表2抗CD4嵌合抗體及鼠源性單抗對(duì)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用Tab2Theinhibitoryeffectsoftheanti-CD4chimerican

16、tibodyandmurineMcAbonone-waymixedlymphocytereaction（MLR）concentrationofantibody（gml）chimericantibodymurineMcAbn±sn±s050500.15230±156*5121±980*105484±132*5334±112*105655±143*5460±760*1005664±126*5512±960*P0.05，*P0.01，comparedwithcontrolgroup 3討論通過(guò)基因工程

17、技術(shù)，建立了穩(wěn)定分泌抗CD4人-鼠嵌合抗體的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞4，且所保存的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞經(jīng)多次凍存和復(fù)蘇后仍具有穩(wěn)定表達(dá)和分泌抗CD4人-鼠嵌合抗體的能力。相對(duì)親和力測(cè)定結(jié)果表明，嵌合抗體能與鼠源性單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD4分子。隨著先加入嵌合抗體濃度的增加，能結(jié)合到CEM細(xì)胞表面的CD4嵌合抗體減少，故熒光陽(yáng)性細(xì)胞亦隨之減少。當(dāng)固定檢測(cè)抗體濃度，將競(jìng)爭(zhēng)抗體稀釋成不同濃度時(shí)，兩種抗體不同稀釋度的競(jìng)爭(zhēng)抑制率基本相同。說(shuō)明抗CD4人-鼠嵌合抗體與鼠源性單抗對(duì)CD4抗原具有相同親和力，且結(jié)合位點(diǎn)一致。在相對(duì)親和力相同的情況下對(duì)嵌合抗體的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究，為其在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。抗CD3 McAb是T細(xì)胞

18、多克隆刺激劑7，在低濃度時(shí)能通過(guò)TCR途徑刺激T細(xì)胞活化增殖。混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)通常使用同種PBMC或分離的T、B細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，但這些細(xì)胞不易標(biāo)準(zhǔn)化。EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞可高表達(dá)MHC-類分子和B7-1、B7-28，因此具有較強(qiáng)的刺激效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力，且易標(biāo)準(zhǔn)化，故本實(shí)驗(yàn)所用的同種細(xì)胞性抗原為EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞?？笴D3 McAb及同種異體細(xì)胞性抗原均是經(jīng)TCR途徑刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗CD4嵌合抗體和鼠源性單抗對(duì)由抗CD3McAb及同種異體細(xì)胞性抗原誘導(dǎo)的PBMC增殖均有抑制作用，其增殖抑制效應(yīng)是劑量依賴性的，在抗體濃度為10gml時(shí)達(dá)最大抑制效應(yīng)。抗CD4抗體

19、對(duì)IL-2誘導(dǎo)的PBMC增殖的抑制作用較弱9。提示，抗CD4抗體的抑制作用很大程度上直接作用于TCR誘導(dǎo)的活化信號(hào)，CD4分子的交聯(lián)干擾了TCR刺激后組成的多功能傳導(dǎo)復(fù)合體的形成。由于抗CD4抗體封閉了細(xì)胞表面CD4分子，使T細(xì)胞不能與MHC-類分子結(jié)合，從而使T細(xì)胞缺乏活化必需的信號(hào)而變成無(wú)能（anergy）10?？笴D4抗體對(duì)由IL-2誘導(dǎo)的增殖抑制作用較弱，而對(duì)由TCR途徑刺激的PBMC增殖抑制作用較強(qiáng)，從而提示抗CD4抗體的抑制作用機(jī)制可能是：阻斷與MHC-類分子非多態(tài)區(qū)相互作用的位點(diǎn)；從空間排列上阻止CD3和CD4的共聚集；通過(guò)CD4分子介導(dǎo)T細(xì)胞傳遞陰性信號(hào)；經(jīng)CD4使P56lck

20、募集到TCR復(fù)合物上，對(duì)于最有效的TCR鏈磷酸化和Zap70的活化很重要，Zap70的活化是導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗CD4抗體可能是通過(guò)阻止P56lck的募集使CD4與TCR復(fù)合體隔離開(kāi)來(lái)，從而使T細(xì)胞不能被活化?；痦?xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39370628）作者簡(jiǎn)介張智紅（1971），女，湖北武漢市人，助理講師，碩士，主要從事分子免疫學(xué)的研究，現(xiàn)在工作單位：華中理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究所，武漢430074。張智紅（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，湖北武漢430030）沈關(guān)心（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，湖北武漢430030）楊敬（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，湖北武漢430

21、030）朱慧芬（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，湖北武漢430030）張悅（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，湖北武漢430030）參考文獻(xiàn)1  PANAVI GS，LANCHSTRY JS，KINOSKEY GHThe importance of the T cell in initiating and maintaining the chronic synovitis of rheumatoid arthritisJArthritis Rheum，1992，35（7）：7297352  WALDMANN HManipulation of T Cell responses with monoclonal antibodies JAnnu Rev Immunol，1989，7：4074443  QIN S，COBBOLD SP，PIPEH et alInfectious transplantation tolerance JScience，1993，259（5 097）：9749774  SHEN GX，ZHU ZG，ZHU HF