抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定及對PBMC增殖反應的影響

1、    抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定及對PBMC增殖反應的影響        摘要目的對已構建表達的抗CD4人-鼠嵌合抗體的生物學特性進行鑒定，比較嵌合抗體與鼠源性單抗對抗CD3McAb和EBV轉(zhuǎn)化細胞誘導的外周血單個核細胞（PBMC）增殖反應的影響，以探討抗CD4抗體的增殖抑制作用機制。方法采用間接免疫熒光競爭抑制實驗比較兩種抗體對CD4抗原的相對親和力，MTT法檢測抗CD4抗體的增殖抑制作用。結果轉(zhuǎn)染瘤細胞具有穩(wěn)定表達及分泌特異性抗CD4人-鼠嵌合抗體的能力；兩種抗體對C

2、D4抗原的相對親和力相同；對經(jīng)TCR途徑刺激誘導的PBMC增殖反應均有抑制作用，嵌合抗體的增殖抑制作用較鼠源性單抗強。結論抗CD4抗體的抑制作用很大程度上直接作用于TCR誘導的活化信號。關鍵詞人-鼠嵌合抗體；相對親和力；增殖抑制效應中分類號R392.11 文獻標識碼A文章編號1000-8861（2000）04-0265-03 Identification of anti-CD4 chimeric antibody and detection of    its effects on PBMC proliferationZHANG Zhi-hong，SHEN Guan-xin

3、，YANG Jing，ZHU Hui-fen，ZHANG Yue（Department of Immunology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）Abstract Objective  To explore the mechanism of the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） proliferation，we identified the biological characte

4、ristic of the anti-CD4 humanmurine chimeric antibody，and compared their effects of the chimeric antibody with murine McAb on PBMC proliferation induced by anti-CD3 McAb or EBV transformed cellMethods  Using indirect immunofluorescence competed inhibiting experiment to compare two kinds of anti-

5、CD4 antibodies on relative affinity，and to detect the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on PBMC proliferation with MTT testResults  Transfectoma has the ability to express and secrete specific anit-CD4 Humanmurine chimeric antibody stablyChimeric antibody has the same relative affinity as

6、 murine McAbBoth the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb could inhibit PBMC proliferation induced by TCR approach，and chimeric antibody has better inhibitory effects than murine McAbConclusion  Most important inhibitory effects of the anti-CD4 antibody appeared to direct at TCR-induced a

7、ctivation signalsKey words Humanmurine chimeric antibody； relative affinity； inhibitory effects on proliferationCD4T細胞在免疫應答過程中起著重要作用1，抗CD4抗體可通過不同途徑阻斷CD4T細胞的功能，調(diào)控機體的免疫應答?？笴D4抗體在自身免疫性疾病治療和抗移植排斥反應中具有極大的潛力2，3。目前國內(nèi)抗CD4抗體均為鼠源性，用基因工程技術對鼠源性單抗進行改造，構建人-鼠嵌合抗體，既可保持鼠源性單抗的特異性，又降低了對人體的免疫原性。因此，將治療性鼠源性單抗轉(zhuǎn)變成人-鼠嵌合抗體具有

8、很大的臨床應用價值。為此我們對已構建表達的抗CD4人-鼠嵌合抗體的生物學特性進一步進行了鑒定，并比較嵌合抗體與鼠源性單抗對刺激原誘導的PBMC增殖抑制作用。1材料與方法1.1細胞株和細胞系分泌鼠源性抗人CD4單克隆抗體（MCA3）及抗人CD3單克隆抗體的雜交瘤細胞株，均從ATCC公司引進；分泌抗人CD4人-鼠嵌合抗體D4.9的轉(zhuǎn)染瘤細胞株由本室構建4；EBV轉(zhuǎn)化的B細胞由本教研室吳雄文副教授課題組制備；T細胞淋巴瘤細胞系（CEM），由德國埃爾蘭根大學臨床免疫研究所引進。1.2主要試劑MTT為Sigma產(chǎn)品；絲裂霉素C為KgowaHakkoKogyoCo，Ltd產(chǎn)品；FITC標記羊抗人IgG為上

9、海生物制品研究所產(chǎn)品；鼠抗人鏈單克隆抗體為Sigma產(chǎn)品；羊抗人IgG、羊抗小鼠IgG、HRP標記羊抗小鼠IgG為華美公司產(chǎn)品。1.3腹水型抗體的制備及純化5采用辛酸提取法對兩種腹水型抗CD4抗體進行純化，用U-200型紫外分光光度儀分別測其OD260和OD280值，根據(jù)公試計算IgG濃度6：IgG濃度（mgml）（145×OD2800.74×OD260）×稀釋倍數(shù)1.4抗CD4人-鼠嵌合抗體的鑒定采用交叉夾心ELISA法鑒定轉(zhuǎn)染瘤細胞分泌抗體的Ig類型；以PBMC或CEM細胞為靶細胞，采用間接免疫熒光法鑒定抗體的特異性。1.5相對親和力的測定用間接免疫熒光法，經(jīng)

10、流式細胞儀計數(shù)檢測CEM細胞表達CD4抗原的陽性率，分別檢測純化的抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗與CEM細胞結合的飽和抗體濃度。用間接免疫熒光競爭抑制實驗檢測抗CD4嵌合抗體和鼠源性單抗對CD4抗原的相互競爭抑制作用。1.6PBMC增殖實驗取一個單位健康人除紅細胞的抗凝血（200ml），通過密度梯度離心常規(guī)分離獲得PBMC。96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100l2×106mlPBMC懸液，然后分別加入不同濃度的抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗（終濃度為0.1、1、10、100gml），均設3復孔，設加入非特異性人IgG作為陰性對照，振蕩混合后，置4°C孵育1h，分別加入抗CD3 Mc

11、Ab（雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液）或絲裂霉素C（終濃度為25 gml）處理后的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞（1×106ml），置37°C、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結束后每孔加10lMTT（5mgml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，2 000rmin離心5min，去上清，每孔加入100l DMSO，振蕩5min后，用酶標儀測570nm的OD值，記錄結果。根據(jù)公式計算各實驗組抗CD4抗體的增殖抑制率：1.7數(shù)據(jù)處理各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組資料分析應用二組均數(shù)t檢驗其差異的顯著性。2結果2.1抗CD4嵌合抗體的特異性ELISA試驗表明，轉(zhuǎn)染瘤細胞分泌的抗體

12、能與抗人抗體和抗人輕鏈抗體反應，不與抗鼠抗體反應，從而證明此轉(zhuǎn)染瘤細胞株分泌的抗體為含有人的恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)的抗體。采用間接免疫熒光法證明，轉(zhuǎn)染瘤細胞分泌的抗體，與人PBMC反應的陽性率為3540，與CEM細胞均呈陽性免疫熒光反應。其熒光強度與鼠源性CD4單抗相似，而與CD4抗原陰性的Raji細胞呈陰性反應。2.2抗體相對親和力的測定CEM細胞為CD4抗原表達陽性細胞，流式細胞儀檢測證明陽性率為96.49，純化的抗CD4嵌合抗體和鼠源性抗CD4單抗與2×105CEM細胞結合的飽和抗體濃度均為10gml。采用間接免疫熒光競爭抑制實驗證明，當將抗CD4嵌合抗體以每毫升0、0.1、1、

13、10和100g分別與2×105CEM細胞作用后，鼠源性抗CD4單抗熒光染色細胞的熒光強度逐漸減弱，且熒光染色陽性細胞數(shù)也逐漸減少，分別為95.43、89.93、51.20、17.87、11.93。當將鼠源性CD4單抗以每毫升0、0.1、1、10和100g分別與2×105CEM細胞作用后，抗CD4人-鼠嵌合抗體熒光染色細胞的熒光強度逐漸減弱，且熒光染色陽性細胞數(shù)也逐漸減少，分別為96.49、90.92、49.98、16.92、6.54。2.3抗CD4抗體的增殖抑制效應抗CD4嵌合抗體或鼠源性單抗對抗CD3 McAb（見表1）或EBV轉(zhuǎn)化的B細胞（見表2）誘導的PBMC增殖均有

14、抑制作用。當抗CD4嵌合抗體濃度為0.1gml時對PBMC增殖已有抑制作用。當抗體濃度達10gml時，抑制作用明顯增強。當繼續(xù)增加抗體濃度時，未見抑制效應隨著抗體濃度的增加而增強。表明當抗體濃度達10gml時即達最大抑制效應濃度。抗CD4嵌合抗體對幾種刺激物誘導的增殖抑制作用明顯強于鼠源性單抗。表1抗CD4嵌合抗體及鼠源性單抗對抗CD3 McAb誘導PBMC增殖反應的抑制作用Tab1Theinhibitoryeffectsoftheanti-CD4chimericantibodyandmurineMcAbonanti-CD3inducedPBMCproliferationconcentrati

15、onofantibody（gml）chimericantibodymurineMcAbn±sn±s050500.1510.5±73*5630±37105299±99*510.3±67*105520±138*530.5±87*1005580±10.7*5321±98*P0.05，*P0.01，comparedwithcontrolgroup 表2抗CD4嵌合抗體及鼠源性單抗對單向混合淋巴細胞反應的抑制作用Tab2Theinhibitoryeffectsoftheanti-CD4chimerican

16、tibodyandmurineMcAbonone-waymixedlymphocytereaction（MLR）concentrationofantibody（gml）chimericantibodymurineMcAbn±sn±s050500.15230±156*5121±980*105484±132*5334±112*105655±143*5460±760*1005664±126*5512±960*P0.05，*P0.01，comparedwithcontrolgroup 3討論通過基因工程

17、技術，建立了穩(wěn)定分泌抗CD4人-鼠嵌合抗體的轉(zhuǎn)染瘤細胞4，且所保存的轉(zhuǎn)染瘤細胞經(jīng)多次凍存和復蘇后仍具有穩(wěn)定表達和分泌抗CD4人-鼠嵌合抗體的能力。相對親和力測定結果表明，嵌合抗體能與鼠源性單抗競爭結合CD4分子。隨著先加入嵌合抗體濃度的增加，能結合到CEM細胞表面的CD4嵌合抗體減少，故熒光陽性細胞亦隨之減少。當固定檢測抗體濃度，將競爭抗體稀釋成不同濃度時，兩種抗體不同稀釋度的競爭抑制率基本相同。說明抗CD4人-鼠嵌合抗體與鼠源性單抗對CD4抗原具有相同親和力，且結合位點一致。在相對親和力相同的情況下對嵌合抗體的生物學效應進行研究，為其在臨床上的應用提供科學實驗依據(jù)?？笴D3 McAb是T細胞

18、多克隆刺激劑7，在低濃度時能通過TCR途徑刺激T細胞活化增殖。混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗通常使用同種PBMC或分離的T、B細胞作為刺激細胞，但這些細胞不易標準化。EBV轉(zhuǎn)化的B細胞可高表達MHC-類分子和B7-1、B7-28，因此具有較強的刺激效應T細胞增殖的能力，且易標準化，故本實驗所用的同種細胞性抗原為EBV轉(zhuǎn)化的B細胞?？笴D3 McAb及同種異體細胞性抗原均是經(jīng)TCR途徑刺激誘導T細胞活化增殖的。本實驗結果表明，抗CD4嵌合抗體和鼠源性單抗對由抗CD3McAb及同種異體細胞性抗原誘導的PBMC增殖均有抑制作用，其增殖抑制效應是劑量依賴性的，在抗體濃度為10gml時達最大抑制效應?？笴D4抗體

19、對IL-2誘導的PBMC增殖的抑制作用較弱9。提示，抗CD4抗體的抑制作用很大程度上直接作用于TCR誘導的活化信號，CD4分子的交聯(lián)干擾了TCR刺激后組成的多功能傳導復合體的形成。由于抗CD4抗體封閉了細胞表面CD4分子，使T細胞不能與MHC-類分子結合，從而使T細胞缺乏活化必需的信號而變成無能（anergy）10。抗CD4抗體對由IL-2誘導的增殖抑制作用較弱，而對由TCR途徑刺激的PBMC增殖抑制作用較強，從而提示抗CD4抗體的抑制作用機制可能是：阻斷與MHC-類分子非多態(tài)區(qū)相互作用的位點；從空間排列上阻止CD3和CD4的共聚集；通過CD4分子介導T細胞傳遞陰性信號；經(jīng)CD4使P56lck

20、募集到TCR復合物上，對于最有效的TCR鏈磷酸化和Zap70的活化很重要，Zap70的活化是導致T細胞增殖的關鍵環(huán)節(jié)，抗CD4抗體可能是通過阻止P56lck的募集使CD4與TCR復合體隔離開來，從而使T細胞不能被活化?；痦椖繃易匀豢茖W基金資助項目（39370628）作者簡介張智紅（1971），女，湖北武漢市人，助理講師，碩士，主要從事分子免疫學的研究，現(xiàn)在工作單位：華中理工大學生命科學與技術學院生物醫(yī)學光子學研究所，武漢430074。張智紅（同濟醫(yī)科大學免疫學教研室，湖北武漢430030）沈關心（同濟醫(yī)科大學免疫學教研室，湖北武漢430030）楊敬（同濟醫(yī)科大學免疫學教研室，湖北武漢430

21、030）朱慧芬（同濟醫(yī)科大學免疫學教研室，湖北武漢430030）張悅（同濟醫(yī)科大學免疫學教研室，湖北武漢430030）參考文獻1  PANAVI GS，LANCHSTRY JS，KINOSKEY GHThe importance of the T cell in initiating and maintaining the chronic synovitis of rheumatoid arthritisJArthritis Rheum，1992，35（7）：7297352  WALDMANN HManipulation of T Cell responses with monoclonal antibodies JAnnu Rev Immunol，1989，7：4074443  QIN S，COBBOLD SP，PIPEH et alInfectious transplantation tolerance JScience，1993，259（5 097）：9749774  SHEN GX，ZHU ZG，ZHU HF