異基因造血干細胞移植后人類皰疹病毒6型感染及其與巨細胞病毒感染的相關(guān)性

1、異基因造血干細胞移植后人類皰疹病毒6型感染及其與巨細胞病毒感染的相關(guān)性         08-03-07 09:55:00     編輯：studa20              作者：王立茹董陸佳陸道培【摘要】  為了解人類皰疹病毒6型（human herpesvirus 6, HHV-6）在中國接受異基因造血干細胞移植（hematop

2、oietic stem cell transplantation, HSCT）的人群中感染現(xiàn)狀及其與巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染的相關(guān)性，對72例接受HSCT的患者HHV-6 DNA血癥進行連續(xù)監(jiān)測。收集HSCT患者移植前和移植后1-12周EDTA抗凝的外周血標(biāo)本共680份，采用巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢測外周血單個核細胞中HHV-6 DNA，并利用Hind 限制性內(nèi)切酶對HHV-6進行基因分型，同時采用免疫熒光法檢測CMV抗原血癥。結(jié)果顯示，HSCT后62.5%（45/72）的患者至少1次出現(xiàn)HHV-6 DNA血癥，首次檢出的中位時間為14（7-63）天；除1例患者檢出

3、HHV-6A型以外，其余所有HHV-6陽性患者均為HHV-6B型感染。65.3%（47/72）的移植后患者至少1次發(fā)生CMV抗原血癥，首次檢出的中位時間為43（14-105）天。HHV-6與CMV共感染（CMV+/HHV-6+）的發(fā)生率為52.8%（38/72）。HHV-6 DNA血癥的首次檢出時間早于CMV抗原血癥（P<0.0001）。HHV-6 DNA血癥陽性患者CMV抗原血癥檢出率顯著高于HHV-6血癥陰性患者84.4% (38/45) vs 33.3% (9/27), P=0.0001。HSCT后的皰疹病毒感染相關(guān)疾病中出血性膀胱炎（HC）發(fā)生率較高23.6% (17/72)，其

4、中88.2%（15/17）的HC發(fā)生于HHV-6血癥陽性患者，82.3%（14/17）發(fā)生于CMV+/HHV-6+患者。結(jié)論：HSCT后HHV-6感染以及HHV-6與CMV共感染狀態(tài)普遍存在，且發(fā)生于移植后早期的HHV-6感染與發(fā)生時間相對較晚的CMV感染之間可能存在相關(guān)性。 【關(guān)鍵詞】  造血干細胞移植；人類皰疹病毒6型；巨細胞病毒Prevalence of Human Herpesvirus-6  in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipients in Correlation with  C

5、ytomegalovirus InfectionAbstract In order to study the prevalence of human herpesvirus 6 (HHV-6) in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (allo-HSCT) recipients in China and to analyze the relationship between HHV-6 and cytomegalovirus (CMV)  infection in post-HSCT patients, nested poly

6、merase chain reaction (PCR) was used to monitor HHV-6 DNAemia in 72 consecutive allo-HSCT recipients. 680 EDTA anticoagulated peripheral blood specimens were gathered before HSCT or weekly until 12 weeks after allo-HSCT. The variants of HHV-6 were identified by Hind restriction analysis. CMV-pp65 an

7、tigenemia was detected  by immunofluresence stain. The results showed that HHV-6 DNAemia was detected at least once in 62.5% (45/72) of the patients on the median day 14 (range, 7-63 days) after allo-HSCT, and HHV-6B was the predominant variant. CMV antigenemia was detected at least once in 65.

8、3% (47/72) of the patients on the median day 43 (range, 14-105 days) after allo-HSCT. Co-infection of HHV-6 and CMV (HHV-6+/CMV+) occurred in 52.8% (38/72) recipients. The onset of HHV-6 DNAemia was earlier than that of CMV antigenemia (P<0.0001). Patients with HHV-6 DNAemia positive were more li

9、kely to have concurrent CMV antigenemia than HHV-6 DNAemia negative patients (84.4% vs 33.3%, P=0.0001) after allo-HSCT. Among the herpesvirus related disease, the relatively high incidence of hemorrhage cystitis (HC)  occurred in 23.6%  (17/72) of post-HSCT patients. 88.2% (15/17) of HC d

10、eveloped in HHV-6 positive patients，and 82.3% (14/17) occurred in CMV+/HHV-6+ patients. It is  concluded that infection of HHV-6, co-infection of HHV-6 and CMV,  commonly occurred in post-HSCT patients in  China, HHV-6 infection closely  related to CMV antigenemia.Key wordshemato

11、poietic stem cell transplantation; human herpesvirus 6; cytomegalovirus人類皰疹病毒6型（human herpesvirus 6, HHV-6）與巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）同屬于皰疹病毒亞家族。根據(jù)基因組多態(tài)性，HHV-6可以分為A、B兩個變異型，其中以HHV-6B型最為常見，其原發(fā)感染多見于2歲以內(nèi)的兒童，是幼兒急疹的主要原因，在2歲以上人群中的血清抗體檢出率達到90%以上1。HHV-6以CD46分子為受體感染細胞2，由于CD46廣泛分布于唾液腺、淋巴組織、血管系統(tǒng)、腎臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠

12、質(zhì)細胞，在HHV-6宿主細胞范圍內(nèi)分布也相對廣泛。除了主要對CD4+T細胞具有親嗜性以外3，HHV-6還對單核細胞、唾液腺細胞、NK細胞、腦組織的少突膠質(zhì)細胞、星狀細胞4等具有親嗜性。與皰疹病毒家族的其他成員相同，原發(fā)感染后HHV-6在宿主體內(nèi)長期處于潛伏狀態(tài)，當(dāng)宿主免疫被抑制后，如造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT），體內(nèi)潛伏的HHV-6可以再活化。大量研究結(jié)果提示，CMV感染及其合并癥是影響HSCT患者預(yù)后的重要原因，因此臨床上對移植后CMV感染的防治相當(dāng)重視，但是HHV-6的研究歷史較短，對其在HSCT患者體內(nèi)的致病

13、過程尚未得到足夠認識。新近國外報道，HSCT后40%-50患者出現(xiàn)HHV-6感染5，與HSCT后中樞神經(jīng)系統(tǒng)合并癥6、間質(zhì)性肺炎7、骨髓抑制8等的發(fā)生可能存在相關(guān)性。HHV-6與CMV在基因序列上有高度同源性，因而在生物學(xué)特性方面也存在很多共性。Razonable等9發(fā)現(xiàn)在實體器官移植中，常常發(fā)生HHV-6與CMV同時感染。Chapenko等10認為，與HHV-6同源性更近的另一皰疹病毒家族成員HHV-7和CMV共感染是增加腎移植患者“CMV病”發(fā)生率的危險因素。HSCT后HHV-6感染及其與CMV感染的關(guān)系國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本研究應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)（ nested  PCR）和免

14、疫熒光法分別監(jiān)測HSCT后HHV-6和CMV感染，并分析HHV-6感染與CMV感染以及皰疹病毒感染相關(guān)疾病的關(guān)系。材料和方法患者特征及樣本采集2004年5月至2005年6月接受HSCT的患者共72例。收集患者移植前和移植后1-12周EDTA抗凝的外周血樣本共680份。患者特征為：男性41例，女性31例，中位年齡27.5（8-58）歲；急性髓性白血病19例，急性淋巴細胞白血病16例，慢性粒細胞白血病22例，非霍奇金淋巴瘤6例，骨髓增生異常綜合征4例，再生障礙性貧血2例，急性早幼粒細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和急性混合細胞白血病各1例。HLA配型相合親緣供者HSCT 25例，HLA配型相合非血緣HSC

15、T 4例，HLA部分相合親緣供者HSCT 43例。對HLA配型相合親緣供者HSCT患者給予馬利蘭加環(huán)磷酰胺為主的改良BU/CY方案或分次全身照射加環(huán)磷酰胺方案預(yù)處理；非血緣或HLA部分相合HSCT患者給予含抗胸腺細胞球蛋白的預(yù)處理方案。移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）預(yù)防方案為環(huán)孢菌素A、霉酚酸酯聯(lián)合短療程氨甲喋呤。所有患者在預(yù)處理期間靜脈應(yīng)用更昔洛韋（GCV）5 mg/kg，每12小時1次，移植當(dāng)天至移植60天以后每天給予阿昔洛韋（ACV）0.8  g，預(yù)防病毒感染。對CMV抗原血癥陽性或出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、出血性膀胱炎（hemorrha

16、gic cystitis, HC）和胃腸炎等皰疹病毒感染相關(guān)疾病的患者給予更昔洛韋（GCV）或磷甲酸（PFA）干預(yù)性治療。治療急性GVHD主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。將采集的外周血樣本經(jīng)裂解紅細胞后獲得外周血單個核細胞，應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天為時代公司產(chǎn)品）提取基因組DNA，用紫外分光光度計（TU-1901型，北京譜析通用儀器有限公司產(chǎn)品）測定DNA濃度，然后-40保存。HHV-6 DNA血癥的巢式PCR檢測巢式PCR引物11擴增HHV-6 U31基因片段。HHV-6外引物序列：5-TTAACGGTCGCGTTCTA ACC-3 ，和5-ACGCCTCGTTGAATACTTCG-3，擴

17、增產(chǎn)物為1 216 bp片段；內(nèi)引物序列：5-AAGAAGG CTATCACTTAGACACGG-3 和5-TTAGGATAAG AAGCTCGGCG-3，擴增產(chǎn)物為492 bp片段。PCR反應(yīng)體系為50 l，含10×PCR buffer (Mg2+)，2.5 mol/L dNTP，10 mol/L上、下游引物，1.25 U  r-Taq DNA聚合酶（大連寶生物公司產(chǎn)品），100 ng模板DNA。第一輪PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性3分鐘；94變性30秒；55退火30秒；72延伸60秒；35個循環(huán)后72后延伸7分鐘。第二輪PCR反應(yīng)條件：以2  l第一次反應(yīng)產(chǎn)物為模

18、板，反應(yīng)條件同第一次反應(yīng)。擴增產(chǎn)物2瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下檢測。每一次巢式PCR反應(yīng)均設(shè)立不含模板的陰性對照，同時以含有HHV-6目的片段的質(zhì)粒為陽性對照。陽性標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建和巢式PCR反應(yīng)敏感性檢測將巢式PCR第一次反應(yīng)擴增陽性片段回收后與PMD-18載體連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒酶切雙重鑒定的含有目的片段的菌液送北京諾賽基因中心測序，序列與GenBank公布序列一致，則將所提取的質(zhì)粒作為本實驗的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。將陽性標(biāo)準(zhǔn)品由高濃度108/l至101/l依次10倍稀釋后，繼續(xù)稀釋至5 copies/l和1 copy/l，取1 l作為PCR模板檢測PCR反應(yīng)的敏感性

19、。限制性酶切HHV-6 PCR產(chǎn)物分型HHV-6B型PCR擴增產(chǎn)物片段上含有Hind 酶切位點，可以產(chǎn)生370和122 bp的兩個片段，HHV-6A型擴增產(chǎn)物片段上則不含Hind 酶切位點。酶切反應(yīng)體系20 l，含HHV-6陽性PCR產(chǎn)物4 l，Hind 內(nèi)切酶（大連寶生物公司產(chǎn)品）5 U，37酶切1小時后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定HHV-6的分型。CMV抗原血癥檢測分離EDTA抗凝的外周血中單個核細胞，將細胞濃度調(diào)整至濃度為106/ml，離心涂片，每張玻片含105個單個核細胞。采用CMV BriteTM試劑盒（荷蘭IQ公司產(chǎn)品）進行免疫熒光標(biāo)記，通過間接免疫熒光法檢測CMV p

20、p65陽性率，每張玻片CMV pp65陽性細胞1判定為陽性結(jié)果。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包處理，HHV-6與CMV感染累積發(fā)生率采用Log-rank檢驗比較，感染發(fā)生的時間采用Mann-Whitny U檢驗比較，以P<0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果巢式PCR特異性和敏感性PCR陽性片段與載體連接后構(gòu)建的質(zhì)粒，經(jīng)測序與GenBank HHV-6標(biāo)準(zhǔn)株U31基因序列一致，因此該質(zhì)粒可以作為巢式PCR擴增HHV-6 U31基因片段的標(biāo)準(zhǔn)品。本實驗所選引物序列經(jīng)過與GenBank中序列對比發(fā)現(xiàn)，它只特異性擴增HHV-6 DNA，對其他皰疹病毒DNA無交叉擴增作用。以系列稀釋的質(zhì)粒

21、作為模板，檢測PCR擴增HHV-6 U31基因的敏感性是5個基因組拷貝。移植前、后HHV-6血癥及移植后CMV血癥的累積發(fā)生率HHV-6 DNA檢出率移植前患者中為11.1%（8/72），而移植后患者中為62.5%（45/72）。這些患者至少1次出現(xiàn)HHV-6 DNA血癥陽性（圖1），首次檢出的中位時間為14（7-63）天。經(jīng)Hind 酶切鑒定，除1例患者的3份樣本檢出HHV-6A型以外，其余HHV-6感染患者皆為HHV-6B型（圖2）。移植后65.3%（47/72）的患者至少1次出現(xiàn)CMV抗原血癥（圖1），首次檢出的中位時間為43（14-105）天。移植后HHV-6 DNA血癥和CMV抗原血

22、癥隨時間的動態(tài)演變見圖3，HHV-6 DNA血癥在移植后2-7周維持較高水平，其中移植后4周陽性率最高（40%），CMV抗原血癥的在移植后6-8周較高，以移植后6周最高（25%）。移植后HHV-6與CMV感染的相關(guān)性移植后HHV-6 DNA血癥發(fā)生的時間顯著早于CMV抗原血癥（P<0.0001）。移植后HHV-6 DNA血癥陽性患者中CMV抗原血癥檢出率為84.4%（38/45），顯著高于HHV-6 DNA血癥陰性患者CMV抗原血癥檢出率33.3%（9/27）（P0.0001)(圖4）。HHV-6、CMV感染與皰疹病毒感染相關(guān)性疾病移植后7例患者出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，其中3例既存在CMV感染，又有HHV-6感染，有3例只有CMV感染，1例只有HHV-6感染。3例患者發(fā)生移植后胃腸炎，此3例患者均檢出CMV抗原，1例患者存在HHV-6感染。由于間質(zhì)性肺炎和胃腸炎的發(fā)生率低，無法進行統(tǒng)計學(xué)分析。72例患者中17例（23.6%）患者發(fā)生HC，88.2%（15/17）發(fā)生于HHV-6或CMV血癥陽性患者，其中HHV-6血癥陽性患者HC累積發(fā)生率為33.3%（15/45），顯著高于HH