PAGE,SDS-PAGE電泳分離ppt課件

1、華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 聚丙烯酰胺凝膠的構(gòu)成 丙烯酰胺和甲叉雙聚丙烯酰胺為聚合單體,在聚合催化劑的催化下,聚合為聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化劑過硫酸銨和四甲基乙二胺(TEMED)光和化學(xué)核黃素聚合單體丙烯酰胺的濃度和凝膠孔徑的關(guān)系聚丙烯酰胺凝膠通常由濃縮膠和分別膠組成濃縮膠:丙烯酰胺濃度均為4%,起蛋白上樣和濃縮的作用分別膠:起分別蛋白的作用, 丙烯酰胺濃度可以是一樣的(均一膠),也可以是不同的(梯度膠)分別膠的丙烯酰胺濃度由上至下構(gòu)成從低到高的延續(xù)梯度,普通是4%-20%分辨率高可延續(xù)上樣電泳時間長可消除電荷對遷移率的影響 需采用梯度混合器，配制時，濃溶液置于混合室，稀溶液置于儲存室 用pH8

2、.3的電泳緩沖液，電泳向正極進(jìn)展.下槽接正極，上槽接負(fù)極，以溴酚藍(lán)為指示染料 最常用 可用于分析絕大多數(shù)的蛋白酶，由于其pI4.0的蛋白均適用蛋白泳動與蛋白大小，電荷和外形有關(guān)，凝膠兼有分子篩的功能電泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分開一條帶闡明純度高電泳純蛋白酶外形和大小全酶分子量 分析蛋白酶的全酶分子量電場強度溶液pH值離子強度電滲全酶分子量的對數(shù)(Log Mr)和泳動間隔成反比 PAGE的局限性假設(shè)蛋白和雜蛋白的pI相差很大，也要留意有些雜蛋白容易被忽視，由于兩者泳動方向不同蛋白和電泳緩沖液的pH一樣，蛋白不會泳動假設(shè)蛋白酶不同的多聚態(tài)并存，純度高但也能夠呈2-3條帶電泳和其它方法如H

3、PLC高壓液相色譜結(jié)合起來，判別蛋白酶的純度會更可靠!巰基乙醇使蛋自中的二硫鍵復(fù)原1g蛋白和1.4g SDS結(jié)合構(gòu)成蛋白-SDS膠束。SDS帶大量的負(fù)電荷SDS破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵各種蛋白-SDS膠束均帶負(fù)電,且電荷量相近,電泳遷泳率只取決于膠束(亞基Mr)大小使含有亞基的蛋白質(zhì)解離為各個亞基蛋白-SDS膠束長軸的長度和蛋白亞基Mr成正比蛋白-SDS膠束在水溶液中都成橢圓形，其短軸長度都為18A左右測定蛋白亞基Mr研討蛋白純度可結(jié)合PAGE 、HPLC、IEF等研討蛋亞基組成分辨率高(假設(shè)是梯度膠)方便易行是蛋白組學(xué)研討的中心技術(shù)準(zhǔn)確度高(測定誤差不超越10%)SDS負(fù)電荷量遠(yuǎn)高于蛋白的電荷量

4、，不同蛋白之間的蛋白-SDS膠束的電荷是近似的蛋白-SDS膠束均為橢圓形,蛋白之間的膠束的分子外形是近似的蛋白-SDS膠束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4同一蛋白能以不同的比例和SDS結(jié)合蛋白-SDS膠束甚至可以帶負(fù)電荷蛋白-SDS膠束中蛋白電荷量并非都可以忽視空間位阻妨礙蛋白和SDS的充分結(jié)合糖蛋白:糖蛋白的糖基會構(gòu)成空間位阻,亞基Mr的對數(shù)與其電泳遷泳率不成線性關(guān)系蛋白受體:二硫鍵豐富,不容易徹底解離為亞基,所測亞基Mr會偏高含輔酶的復(fù)合蛋白，多酶復(fù)合體等:其亞基Mr能夠測不準(zhǔn)堿性組蛋白和酸性鐵氧還蛋白在SDS-PAGE所測亞基Mr偏高組蛋白亞基Mr為21kD，但測定出為35kD 組

5、蛋白的正電荷抵消了SDS部分負(fù)電荷鐵氧還蛋白的亞基Mr只需8kD，但Rf=0.8鐵氧還蛋白不能和SDS充分結(jié)合強堿性的精蛋白在SDS-PAGE中會沉淀能夠是精蛋白的正電荷和SDS的負(fù)電荷相差無幾磷酸化前后的蛋白激酶能以不同的比例和SDS結(jié)合其構(gòu)象會發(fā)生改動，妨礙了蛋白和SDS的結(jié)合SDS-PAGE中所測亞基Mr會偏高經(jīng)磷酸化后，會使激酶的負(fù)電荷添加， 不同Ca2+濃度下的鈣調(diào)蛋白的疏水性質(zhì)不同 疏水性質(zhì)不同導(dǎo)致和SDS結(jié)合的比例不同 導(dǎo)致鈣調(diào)蛋白有不同的大小鐵氧還蛋白和鈣調(diào)蛋白是酸性蛋白，無論能否和SDS結(jié)合和結(jié)合程度如何，在堿性電泳系統(tǒng)的SDS-PAGE中均向負(fù)極泳動，只是遷移率不同而已假設(shè)

6、堿性蛋白和SDS結(jié)合率很低，達(dá)不到1:1.4,它就能夠向負(fù)極泳動。堿性蛋白能充分和SDS結(jié)合，但其所帶正電荷比SDS負(fù)電荷還要多，使蛋白-SDS膠束帶正電，同樣會向負(fù)極泳動菜心綠葉粗蛋白經(jīng)SDS-醋酸纖維素薄膜電泳,下方為正極,箭頭處為蛋白樣品點樣的位置正極負(fù)極菜心(A)和生菜(B)綠葉粗蛋白經(jīng)SDS-醋酸纖維素薄膜電泳,下方為正極,箭頭處為蛋白樣品點樣的位置正極負(fù)極AB見:梁秀文等.植物綠葉粗蛋白在SDS-PAGE中向負(fù)極泳動的富含苯丙氨酸的堿性蛋白的測定. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報,2019,142：126-129 Fig.SDS-denatured glycolate oxidase from

7、 B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE (A), CE (B) and acetate cellulose membrane electrophoresis (C). The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample 見:曾秋蓮等. 植物中在SDS-PAGE中向負(fù)極泳動的富含苯丙氨酸的蛋白的發(fā)現(xiàn). 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2019, 22(1):86-90很多蛋白經(jīng)一些方法

8、證明是純的，如SDS-PAGE后只需單帶，但I(xiàn)EF卻含多個pI。目前對其中的緣由眾說紛紜，尚無公認(rèn)的解釋，有人以為是空間構(gòu)象不同所引起，但未有確切的證據(jù)。豬生長激素經(jīng)SDS- PAGE后只需28kD帶，IEF卻有6.0-7.2等五個pI。豬生長激素能夠含兩種不同的亞基，其中28kD是個普通蛋白；而另一個亞基那么在SDS -PAGE中是向負(fù)極泳動，因此被忽視 在電泳系統(tǒng)中參與兩性電解質(zhì)載體，通電后，載體兩性電解質(zhì)即在電場中構(gòu)成一個由負(fù)極到正極延續(xù)變化的pH梯度 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì),酶或多肽進(jìn)入這個pH梯度時，不同的蛋白質(zhì)會不斷地泳動,直至到達(dá)(聚焦)與其pI相當(dāng)?shù)膒H位置上 用于分別具有不同pI的蛋白和測定蛋白的pI 分別僅僅決議于蛋白質(zhì)的pI。電泳中區(qū)帶越來越窄，抑制了其他電泳中存在的分散作用。 一旦蛋白質(zhì)到達(dá)它的等電點位置，它就沒有凈電荷，蛋白質(zhì)只能在它的等電點位置被聚焦成一條窄而穩(wěn)定的帶不論樣品加在什么部位，都可以聚焦到與其等電點相當(dāng)?shù)膒H的位置可將pI僅相差0.01-0.02pH單位的蛋白質(zhì)分開早期發(fā)現(xiàn)谷氨酸，組氨酸或賴氨酸能產(chǎn)生大約1pH的梯度但pH范圍太窄，且緩沖才干不夠蛋白質(zhì)分子本身也是兩性電解質(zhì)，在電泳時，它會影響梯度的pH以便在IEF后兩性電解質(zhì)不干擾蛋白的檢測 以便在IEF后易于分開蛋白和兩性電解質(zhì) 不干擾酶活性測定 不干擾免疫檢測不