實驗六、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測ppt課件

1、實驗六實驗六 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取及的提取及檢測檢測基礎(chǔ)性實驗基礎(chǔ)性實驗 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒掌握堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的原理和方法。的原理和方法。 掌握離心機、移液器、震蕩培養(yǎng)箱的正確使用方法。掌握離心機、移液器、震蕩培養(yǎng)箱的正確使用方法。 了解不同構(gòu)型的質(zhì)粒了解不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中泳動速率的在瓊脂糖凝膠中泳動速率的差異。差異。實驗原理實驗原理 質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的能夠自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的能夠自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子。大小在分子。大小在1200kb之間，質(zhì)粒之間，質(zhì)粒DNA通常通常以游離狀態(tài)持續(xù)穩(wěn)定地處

2、于染色體外在一定的條以游離狀態(tài)持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外在一定的條件下又會可逆地整合到寄主染色體上），隨著染色件下又會可逆地整合到寄主染色體上），隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。由體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。由于質(zhì)粒于質(zhì)粒DNA自身具有復(fù)制原點、可攜帶外源基因、自身具有復(fù)制原點、可攜帶外源基因、轉(zhuǎn)移性強、拷貝數(shù)高、帶有選擇性標(biāo)記等特點，使轉(zhuǎn)移性強、拷貝數(shù)高、帶有選擇性標(biāo)記等特點，使得質(zhì)粒成為基因工程中最常用的得質(zhì)粒成為基因工程中最常用的DNA載體。載體。實驗原理實驗原理 l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子具有分子具有3種不同的構(gòu)型：種不同的構(gòu)型：lSC構(gòu)型：共價閉合環(huán)形構(gòu)型：共價

3、閉合環(huán)形DNAcccDNA），質(zhì)粒的），質(zhì)粒的兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)；兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)；lOC構(gòu)型：開環(huán)構(gòu)型：開環(huán)DNAocDNA），質(zhì)粒的兩條多核），質(zhì)粒的兩條多核苷酸鏈中一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈存在苷酸鏈中一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈存在一處至多處斷裂；一處至多處斷裂；lL構(gòu)型：線性構(gòu)型：線性DNAlinear DNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNA發(fā)生發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子。雙鏈斷裂而形成線性分子。實驗原理實驗原理 l同一質(zhì)粒同一質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型盡管相對分子質(zhì)量相同，的不同構(gòu)型盡管相對分子質(zhì)量相同，但在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳遷移率卻是不同的

4、。一但在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳遷移率卻是不同的。一般情況下，泳動速率由快至慢依次為：超螺旋質(zhì)粒般情況下，泳動速率由快至慢依次為：超螺旋質(zhì)粒SC）、線性質(zhì)粒）、線性質(zhì)粒L）、開環(huán)質(zhì)粒）、開環(huán)質(zhì)粒OC）。）。l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取方法較多，要根據(jù)宿主菌和質(zhì)粒的的提取方法較多，要根據(jù)宿主菌和質(zhì)粒的特性選擇適合的提取方法。目前常用的質(zhì)粒提取方法特性選擇適合的提取方法。目前常用的質(zhì)粒提取方法有：堿裂解法、煮沸法。有：堿裂解法、煮沸法。l幾種方法的提取流程是一樣的：培養(yǎng)細菌擴增質(zhì)粒幾種方法的提取流程是一樣的：培養(yǎng)細菌擴增質(zhì)粒收集菌體裂解細胞收集菌體裂解細胞分離和純化質(zhì)粒分離和純化質(zhì)粒DNA。 堿裂解法實驗

5、原理堿裂解法實驗原理 利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體與線狀的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異進行分離。的差異進行分離。SDS使細胞崩解，釋放內(nèi)含物，蛋白質(zhì)變性形使細胞崩解，釋放內(nèi)含物，蛋白質(zhì)變性形成蛋白質(zhì)成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。同時，在復(fù)合物。同時，在pH12.012.5的堿性條件下，線的堿性條件下，線狀的染色體狀的染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然氫鍵斷裂，但兩雖然氫鍵斷裂，但兩條互補鏈仍然相互盤繞而緊密結(jié)合在一起。加入條互補鏈仍然相互盤繞而緊密結(jié)合在一起。加入pH4.8的醋酸鉀高的醋酸鉀高鹽緩沖液使鹽緩沖液使pH降低后

6、，質(zhì)粒降低后，質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈由于彼此靠近而迅的兩條互補鏈由于彼此靠近而迅速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA由于核苷酸鏈較長且兩條互由于核苷酸鏈較長且兩條互補鏈彼此已完全分開，不能迅速復(fù)性，它們相互聚集形成網(wǎng)狀結(jié)補鏈彼此已完全分開，不能迅速復(fù)性，它們相互聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與變性的蛋白質(zhì)及細胞碎片等纏繞在一起。通過離心，染構(gòu)，并與變性的蛋白質(zhì)及細胞碎片等纏繞在一起。通過離心，染色體色體DNA網(wǎng)狀聚合物便與蛋白質(zhì)網(wǎng)狀聚合物便與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物及不穩(wěn)定的大分子一復(fù)合物及不穩(wěn)定的大分子一起沉淀下來，而留在上清液中的質(zhì)粒起沉淀下來，而留在上清液中的質(zhì)粒DNA可用苯

7、酚、氯仿進一步可用苯酚、氯仿進一步抽提純化，通過異丙醇沉淀后可收集質(zhì)粒抽提純化，通過異丙醇沉淀后可收集質(zhì)粒DNA。實驗原理實驗原理 電泳：帶電荷的物質(zhì)在電場中向與自身電荷相反電泳：帶電荷的物質(zhì)在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。在在pH8.0的電泳緩沖液體系中，的電泳緩沖液體系中，DNA分子帶負(fù)電分子帶負(fù)電荷，當(dāng)它處于一個穩(wěn)定的電場中時，從負(fù)極向正荷，當(dāng)它處于一個穩(wěn)定的電場中時，從負(fù)極向正極泳動，遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反極泳動，遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比僅適于線性分子）。比僅適于線性分子）。通過與已知濃度和相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)通過與

8、已知濃度和相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進行對照電泳，觀察其帶型和遷移距離，即片段進行對照電泳，觀察其帶型和遷移距離，即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量。可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量。 瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗材料、主要儀器及試劑實驗材料、主要儀器及試劑 實驗材料實驗材料 prok2系列質(zhì)粒系列質(zhì)粒 主要儀器和用具主要儀器和用具 超凈工作臺、振蕩培養(yǎng)箱超凈工作臺、振蕩培養(yǎng)箱 、微量移液器、微量移液器、 離心機、渦離心機、渦旋振蕩器、制冰機、旋振蕩器、制冰機、 離心管離心管架、架、1.5mL離心管、吸頭、離心管、吸頭、PE手套、儲冰盒、電泳槽、手套、儲冰盒、

9、電泳槽、電源、微波爐、凝膠成像系電源、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。統(tǒng)。 試劑試劑 （1溶液溶液：50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L TrisHClpH8.0） 10 mmol/L EDTApH8.0） 滅菌后滅菌后4保管保管 （2溶液溶液：0.2mol/L NaOH 1% SDSpH值值12.6） （3溶液溶液：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml 水水28.5mlpH4.8） （4LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 （5瓊脂糖瓊脂糖 （71TAE電泳緩沖液電泳緩沖液pH 8.0）：）：10 mmol/LTrisCl 1 mmol/L EDTA （8上樣緩沖液溴酚藍上樣緩沖液溴

10、酚藍 （9） 溴化乙錠溴化乙錠1mg/ml）實驗步驟實驗步驟1. 菌體的培養(yǎng)與收集菌體的培養(yǎng)與收集（1從從LB平板上挑細菌單菌落，接種于平板上挑細菌單菌落，接種于5ml附加相應(yīng)抗生附加相應(yīng)抗生素的素的LB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37250r/min，過夜培養(yǎng)用，過夜培養(yǎng)用對數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒得率高，即測定培養(yǎng)液的對數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒得率高，即測定培養(yǎng)液的OD620=0.20.6時為對數(shù)期的菌液。也可取時為對數(shù)期的菌液。也可取1/100的的過夜菌液，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)過夜菌液，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)2.5h，此時菌液達對數(shù)期）。，此時菌液達對數(shù)期）。（2取取1.2ml菌液放在菌液放在1.5ml的離心管中，的

11、離心管中，5000r/min 4離心離心10min，棄上清上清液中含有細菌生長過程中，棄上清上清液中含有細菌生長過程中的代謝廢物和脫落的細胞壁成分，會影響到質(zhì)粒的質(zhì)量的代謝廢物和脫落的細胞壁成分，會影響到質(zhì)粒的質(zhì)量與內(nèi)切酶酶切的效果。所以離心收集細菌時，上清液應(yīng)與內(nèi)切酶酶切的效果。所以離心收集細菌時，上清液應(yīng)去除干凈，最好用去除干凈，最好用STE或生理鹽水再懸浮漂洗菌體）?；蛏睇}水再懸浮漂洗菌體）。收集菌體后選擇以下方法提取質(zhì)粒。收集菌體后選擇以下方法提取質(zhì)粒。實驗步驟實驗步驟2.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法）的提取堿裂解法）將收集的細菌沉淀懸浮于將收集的細菌沉淀懸浮于100l冰預(yù)冷的溶液冰

12、預(yù)冷的溶液中，強烈中，強烈振蕩混勻；振蕩混勻；加入加入200ul新配的溶液新配的溶液于細菌懸液中，迅速顛倒離心管于細菌懸液中，迅速顛倒離心管5次不應(yīng)振蕩），以混合內(nèi)容物，室溫放置次不應(yīng)振蕩），以混合內(nèi)容物，室溫放置5min或冰或冰上放置上放置3min.加入加入150l預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，顛倒離心管，蓋緊管口，顛倒離心管510次，使溶液次，使溶液在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后將在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后將管置于冰上管置于冰上510min。 實驗步驟實驗步驟 12 000 rpm 12 000 rpm離心離心10 min10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新離心管，將上清液轉(zhuǎn)移

13、至另一新離心管中。中。 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min10 min。 12 000 rpm 12 000 rpm離心離心10 min10 min，棄上清。，棄上清。 加入加入500 l 70500 l 70乙醇，蓋緊管蓋，顛倒并旋轉(zhuǎn)離心管乙醇，蓋緊管蓋，顛倒并旋轉(zhuǎn)離心管以洗滌沉淀。以洗滌沉淀。 12 000 rpm 12 000 rpm離心離心2 min2 min，用移液器吸走上清，打開管蓋，用移液器吸走上清，打開管蓋于室溫下放置于室溫下放置10-15 min10-15 min，使酒精揮發(fā)干凈。，使酒精揮發(fā)干凈。 待沉淀干燥后，加入待沉

14、淀干燥后，加入50 l TE50 l TE緩沖液溶解質(zhì)粒緩沖液溶解質(zhì)粒DNADNA。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測合并下次一起電泳）瓊脂糖凝膠電泳檢測合并下次一起電泳） （1凝膠制備凝膠制備 取瓊脂糖取瓊脂糖0.8g，加入，加入100ml的的1TAE電泳緩沖液，配成濃電泳緩沖液，配成濃度為度為0.8%的瓊脂糖凝膠。微波爐加熱煮沸，使瓊脂糖完全的瓊脂糖凝膠。微波爐加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解注意不要濺出）。待凝膠溶液冷卻至溶解注意不要濺出）。待凝膠溶液冷卻至 60左右時，左右時，加入溴化乙錠至終濃度為加入溴化乙錠至終濃度為0.5gml，倒進制膠模具中。，倒進制膠模具中。 室溫下待凝膠溶液完全凝固，小心取出

15、梳子，將帶有凝膠室溫下待凝膠溶液完全凝固，小心取出梳子，將帶有凝膠的模具放置于電泳槽中。的模具放置于電泳槽中。實驗步驟實驗步驟 （2 2上樣上樣 在在DNADNA樣品中加入樣品中加入1 16 6體積的上樣緩沖液，充分混勻。用體積的上樣緩沖液，充分混勻。用移液器將移液器將DNADNA樣品加入樣品孔中。樣品加入樣品孔中。 （3 3電泳電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，負(fù)極為黑接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，負(fù)極為黑色，色，DNADNA樣品由負(fù)極往正極泳動。電壓降選擇為樣品由負(fù)極往正極泳動。電壓降選擇為l l5V5Vcmcm長度以兩個電極之間的距離計算），電泳的時間根據(jù)不長度

16、以兩個電極之間的距離計算），電泳的時間根據(jù)不同的膠濃度與膠長度而異。同的膠濃度與膠長度而異。 （4 4觀察結(jié)果觀察結(jié)果 電泳結(jié)束后取出膠膜，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照電泳結(jié)束后取出膠膜，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照, ,察看。對察看。對比標(biāo)準(zhǔn)比標(biāo)準(zhǔn)DNADNA條帶和未知條帶和未知DNADNA條帶，觀察其帶型和遷移距離，條帶，觀察其帶型和遷移距離，即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量大小。即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量大小。稱瓊脂糖稱瓊脂糖加加TAE加熱溶解加熱溶解加加EB灌膠灌膠凝固凝固放入電泳槽放入電泳槽加溴酚藍加溴酚藍點樣點樣電泳電泳觀察拍照觀察拍照質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 電泳檢測過程示意圖電泳檢測過程示