逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)銀染分析IRF-1基因在白血病中的表達(dá)

1、    逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)銀染分析IRF-1基因在白血病中的表達(dá)          摘要目的：初步分析白血病細(xì)胞中IRF-1基因表達(dá)水平的變化。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，銀染分析檢測(cè)24例白血病患者和3種白血病細(xì)胞系中IRF-1基因表達(dá)水平。結(jié)果：3例白血病患者未檢測(cè)到IRF-1基因表達(dá)，5例患者及HL-60、HIMeg細(xì)胞系IRF-1基因表達(dá)明顯降低。結(jié)論：部分白血病患者的發(fā)病機(jī)制可能與IRF-1基因表達(dá)缺失或下降有關(guān)；IRF-1基因表達(dá)水平的變化可能對(duì)部

2、分白血病患者的療效觀察及預(yù)后有參考價(jià)值。關(guān)鍵詞聚合酶鏈反應(yīng)銀染分析白血病基因，IRF-1Study on expression of IRF-1 gene in human leukemia with RT-PCR and the silver sequence techniques.Xia Fang,Yuan Youzhong,Zhang Weiping,et al.Changhai Hospital,The Second Military Medical University,Shanghai 200433AbstractObjective：To explore preliminarily

3、 the changes of IRF-1 gene expression in leukemias.Methods：The expression of IRF-1 gene in 24 leukemia patients and 3 leukemic cell lines were studied with RT-PCR and the silver sequence techniques.Results：No expression of IRF-1 gene in 3 patients,and significantly decreased expressions in 5 patient

4、s and in HL-60 and HIMeg cell lines were revealed.Conclusion： The mechanism of human leukemogenesis may be partly associated with no or low-expression of IRF-1 gene.Key wordsPolymerase chain reactionSilvr sequenceLeukemiaGene,IRF-1 抑癌基因的失活和癌基因的激活可能與白血病的發(fā)生和演變有密切關(guān)系1。IRF-1基因定位于5q31.1,其功能是激活I(lǐng)型干擾素和某些干擾素介

5、導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄活性,含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,第2，3，4外顯子序列高度保守2,近來(lái)研究證實(shí)IRF-1基因具有抑癌基因特性3，4。我們采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和銀染技術(shù),對(duì)20例白血病患者及3種細(xì)胞系、7例非惡性血液病患者、8例正常健康人的骨髓細(xì)胞中的IRF-1基因表達(dá)作了分析。初步結(jié)果報(bào)告如下。材料和方法1骨髓細(xì)胞根據(jù)FAB分類(lèi)確診的白血病患者20例,男13例,女7例。初發(fā)急性白血病17例其中有3例在其白血病緩解期(CR)和(或)復(fù)發(fā)期(R)進(jìn)行復(fù)查，慢性粒細(xì)胞白血?。?3例。非惡性血液病7例,男4例,女3例。正常健康人8例,男、女各4例。白血病細(xì)胞系HL-60、K562

6、、HIMeg細(xì)胞株。2引物合成根據(jù)IRF-1基因cDNA序列5,設(shè)計(jì)合成的引物堿基順序如下:I-1：5-TCTTCCCTCTTCCACTCGGAGTCG-3，I-2：5-TGGCACAGCGAAA-GTTGGCC-3，擴(kuò)增片段為第2，3，4外顯子,長(zhǎng)度356bp。-actin基因引物順序?yàn)椋珺-1：5-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3，B-2：5-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3，擴(kuò)增第1，2外顯子，長(zhǎng)度108bp。上述引物由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所合成。3細(xì)胞總RNA提取按異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA6。4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)7 4.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：20l

7、體系內(nèi),包括2g細(xì)胞總RNA，2.5U/l MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,50pmol隨機(jī)引物，1U/l RNA酶抑制劑，500mol/L dNTPs，1×PCR緩沖液，5mmol/L MgCl2。42反應(yīng)30分鐘，99加熱5分鐘，4保存。4.2聚合酶鏈反應(yīng)：50l體系內(nèi),包括1.5mmol/L MgCl2，200mol/L dNTPs，62.5pmol IRF-1基因引物或25pmol -actin基因引物，Taq酶2U，1g總RNA來(lái)源的cDNA模板。94變性45秒，55退火50秒，72延伸1.5分鐘,循環(huán)35周,每次均設(shè)空白對(duì)照和肝臟組織細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。5聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染顯色5l

8、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10乙醇，1.13硝酸(固定液)處理20分鐘,水沖洗23次。12mmol/L硝酸銀(染色液)處理10分鐘,水沖洗23次。3碳酸鈉，0.06甲醛(顯影液)處理1分鐘,晾干。6吸收光密度掃描日本Sharp公司JX330掃描儀，Compaq.575計(jì)算機(jī)，Image-master.TM軟件在相同本底下處理凝膠掃描值。7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t檢驗(yàn),相關(guān)分析。 結(jié)果和討論1我們采用RT-PCR方法擴(kuò)增IRF-1基因片段,以-actin基因?yàn)閰⒄?銀染分析擴(kuò)增產(chǎn)物,以期相對(duì)定量地分析IRF-1基因的表達(dá)情況。正常健康人骨髓細(xì)胞(8例)均檢測(cè)到特異性IRF-1和-actin基因片段,掃描值為：IRF-

9、1 1.04±0.04，-actin 1.73±0.06，IRF-1/-actin 0.60±0.03。我們?nèi)RF-1/-actin0.6為正常掃描值1.00，作為IRF-1基因相對(duì)正常表達(dá)值(R.IRF-1)。7例非惡性血液病患者IRF-1基因表達(dá)與正常組無(wú)明顯差異(0.98±0.04，P>0.01)。2白血病患者檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表，K562、HL-60、HIMeg細(xì)胞系中IRF-1基因表達(dá)分別為0.93,0.28和0.20。17例急性初發(fā)白血病患者中有3例未檢測(cè)到IRF-1基因表達(dá),其IRF-1基因是否缺失,需作進(jìn)一步研究證實(shí)；5例表達(dá)低于0.4

10、，明顯低于正常對(duì)照；4例在0.40.7之間；5例大于0.7。2例慢粒急變患者IRF-1基因表達(dá)也低于0.7。IRF-1基因表達(dá)缺失或下降與白血病FAB分類(lèi)及白血病細(xì)胞比例高低無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示部分白血病的發(fā)生機(jī)制可能與IRF-1基因表達(dá)缺失或下降引起造血細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。317例初發(fā)急性白血病患者中有8例未檢測(cè)附表白血病患者中IRF-1基因表達(dá)情況例號(hào)年齡性別FAB分型R.IRF-1白血病細(xì)胞(%)治療結(jié)果124男M10.9734CR246男M10.5653PR327男M20.4888CR463男M21.0433CR544男M20.3747CR662男M30.4442CR725女

11、M360NR847男M40.2247PR929女M41.1558CR1025男M50.4890CR1144女M50.3567NR1250女M584NR1317男L20.7539PR1445男L20.3357PR1523男L20.7962CR15L2-CR0.75CR1635男M470CR16M4-CR0.26CR16M4-R0.1340NR1758女M50.2868CR17M5-CR0.70CR1857男CML0.93CR1960女CML-BC0.3935NR2048女CML-BC0.6530NR正常健康人骨髓細(xì)胞  1.00     到IRF

12、-1基因或表達(dá)低于0.4，其中3例經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化療后獲完全緩解，CR率僅36.5；9例IRF-1基因0.4者中有7例完全緩解，CR率為77.8。同時(shí)，我們對(duì)3例初發(fā)白血病患者作了緩解期追蹤觀察，2例IRF-1基因表達(dá)大于0.7，1例為0.26,該患者一個(gè)月后即復(fù)發(fā)，IRF-1基因表達(dá)降至0.13，在治療過(guò)程中死亡(見(jiàn)附表)。上述結(jié)果表明，IRF-1基因表達(dá)顯著下降可能與患者的預(yù)后不良有一定關(guān)系,但明確的結(jié)論及其機(jī)制尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及作長(zhǎng)期隨訪深入研究。 參 考 文 獻(xiàn)1Weinberg RA,Edward W,Nibert M,et al.Oncogenes,antioncogenes,and

13、the molecular base of multistep carcinogenes.Cancer Res,1989,49:3713-3720.2Nobuyuki K,Masahiko H,Kitagawa T,et al.Cellular commitment to oncogene-induced transformation or apoptosis is dependent on IRF-1.Cell,1994,77:829-839.3Hisashi M,Eiichi O,Susamu T,et al.Structure and regulation of the human IR

14、F-1 and IRF-2 genes.Mol Cellul Biol,1994,14:1500-1509.4Chery L,Cordelia E,Maria G,et al.Deletion of IRF-1,mapping to 5q31.1, in human leukemia and preleukemic myelodysplasia.Science, 1993,259:968-974.5Ying Y,Simon H,Margaret F,et al.Human IRF-1:intron-exon organization.DNA Cell Biol,1992,11:605-611. 6Piotr G,Nicoletta H.Single-step me