第一章 1-4大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化_圖文

1、1第六節(jié)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化一、基本知識核酸不能自己進入細菌,而是需要幫助,并對細菌經(jīng)過處理,才能穿過細胞的內(nèi)、外膜進入,在里邊表達和復(fù)制。感受態(tài)細胞:受體細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA 分子進入的感受態(tài)細胞(Competent cells 。轉(zhuǎn)化(Transformation :是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。2二、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備常用CaCl 2成批制備感受態(tài)細菌,這些細菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA 產(chǎn)生51062l07個轉(zhuǎn)化

2、菌落,這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒上進行的常規(guī)克隆的需要。適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,并且快速,重復(fù)性更好。制備的感受態(tài)細胞可貯存于-70,數(shù)月至1年。但保存時間過長會使轉(zhuǎn)化效率受到影響。新鮮細胞4 保存可用5天。用于電轉(zhuǎn)化法的感受態(tài)細胞的制備使用低鹽緩沖液或水洗細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA 分子導(dǎo)入受體細胞。(具體操作及參數(shù),參考儀器說明3下列有3個因素對于獲得持續(xù)高的轉(zhuǎn)化頻率來說是至關(guān)重要的:轉(zhuǎn)化緩沖液中試劑的純度細胞的生長狀態(tài)玻璃和塑料器皿的清潔度4例:Cacl 2法制備感受態(tài)細胞(化學(xué)法步驟:1從于37培養(yǎng)1620小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑23mm ,轉(zhuǎn)到一個含有1

3、00ml LB 或SOB 培養(yǎng)基的1L 燒瓶中。于37劇烈振搖培養(yǎng)約3小時。為得到有效轉(zhuǎn)化,活細胞數(shù)不應(yīng)超過108細胞/ml ,可每隔2030分鐘測量OD 600值來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況。2在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分鐘,使培養(yǎng)物冷卻至0。3于4 ,離心10分鐘,以回收細胞。4倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。55以10ml 用冰預(yù)冷的0.1mol /L Cacl 2重懸每份沉淀,放置于冰浴上。6于4,離心10分鐘.以回收細胞。7倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的這量培養(yǎng)液流盡。8每50ml 初始培養(yǎng)

4、物用2ml 用冰預(yù)冷的0.1mol /L CaCl 2重懸每份細胞沉淀。9分裝成200ul ,貯存于-70、4 備用。轉(zhuǎn)化6三、轉(zhuǎn)化方法:電轉(zhuǎn)化法:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA 分子導(dǎo)入受體細胞?；瘜W(xué)方法(熱激法:使用化學(xué)試劑(如CaCl 2制備的感受態(tài)細胞,通過熱擊處理將載體DNA 分子導(dǎo)入受體細胞。7電轉(zhuǎn)化法:當(dāng)大腸桿菌暴露在電場中時,細胞膜會不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成暫時孔洞,于是DNA 分子進入細胞。電穿孔法最初用于將DNA 導(dǎo)入真核細胞,通過優(yōu)化各個參數(shù),每微克DNA 可以得到1091010轉(zhuǎn)化體。影響參數(shù):電場強度;電脈沖的長度;DNA 濃度;質(zhì)粒的大

5、小。一般電轉(zhuǎn)化的效率是用化學(xué)方法制備的感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率的1020倍。而且,制備用于電穿孔的細胞要比制備感受態(tài)細胞更容易得多,低鹽溶液或水洗,加10%的甘油,-70保存。8化學(xué)方法:1用貯存于-70、4 或新鮮的感受態(tài)細胞懸液中各取200ul 轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加DNA (體積10ul ,DNA 50ng ,輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30分鐘。2將管放到預(yù)加溫到42的循環(huán)水浴中,恰恰放置90秒,不要搖動試管。3快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻12分鐘。4每管加800ul SOC 培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37,然后將管轉(zhuǎn)移到37搖床上,溫育45分鐘使細菌復(fù)蘇,并且表達質(zhì)粒編

6、碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率,在復(fù)蘇期中,應(yīng)溫和地?fù)u動細胞。95將適當(dāng)體積(每個90mm 平板可達200ul 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含20mmol /L MgS04和相應(yīng)抗生素的SOB 瓊脂培養(yǎng)基上。用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細胞涂到瓊脂平板表面。6將平板置于室溫直至液體被吸收。7倒置平皿,于37培養(yǎng),1216小時后可出現(xiàn)菌落。10第七節(jié)含重組質(zhì)粒的細菌菌落的鑒定幾種方法來鑒定含重組質(zhì)粒的細菌菌落:1小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA 進行限制酶切分析;2互補;3插入失活;4雜交篩選5菌落PCR 。11一、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA 進行限制酶切分析要挑取一些獨立的轉(zhuǎn)化菌落進行小規(guī)模培養(yǎng)

7、,分離質(zhì)粒DNA 后用限制酶進行消化,再通過凝膠電泳進行分析。該方案頗費氣力,但這是首選的方法。在實際應(yīng)用中,有可能在23小時內(nèi)提取和分析36份小量制備的質(zhì)粒DNA 。12二、互補許多載體都帶有Lac Z 基因的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息,編碼-互補肽,該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補(-互補。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主細胞中時,在異丙基-D 硫代半乳糖苷(IPTG 的誘導(dǎo)下,宿主可同時合成這兩種肽段,雖然它們各自都沒有酶活性,但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。實現(xiàn)-互補現(xiàn)象。由互補產(chǎn)生的-半乳糖苷酶(Lac Z 能夠作用于生色底

8、物(X -gal 而產(chǎn)生藍色的菌落,當(dāng)在載體的該基因編碼序列之間的多克隆位點,插入一個外源DNA 片段時,會造成Lac Z (基因的失活,破壞-互補作用,有重組質(zhì)粒的菌落為白色,而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍色。13-互補現(xiàn)象的檢查:1在一事先制備好的含相應(yīng)抗生素的LB 瓊脂平板上加40ul X gal 貯存液(以20mg /ml 的濃度溶于二甲基甲酰胺中和4ul (IPTG 溶液(濃度為 200mg /ml 。溶液涂布在事先制備的瓊脂平板表面。X -gal 貯存液的配法:將X -gal 溶于二甲基甲酰胺中,配成20mg /ml 濃度的溶液,裝于玻璃或聚丙烯管中,裝溶液的管應(yīng)以錫鉑包裹以防可見光使X

9、 -gal 受到破壞,應(yīng)貯存于-20保存。該溶液不必過濾除菌。IPTG 溶液的配法:將2g IPTG 溶于8ml 水中,用水調(diào)節(jié)體積到10mL 。用0.22um 一次性濾器過濾除菌,分裝成1ml 小份,貯存于-20142將待檢細菌接種到平板上,用接菌環(huán)或牙簽劃線接種,也可將100ul 細菌懸液涂布在瓊脂培養(yǎng)基表面。倒置平板于37培養(yǎng)1216小時。3于4將平板放置數(shù)小時,使藍色充分顯現(xiàn)。帶有-半乳糖苷酶活性蛋白的菌落中間為談藍色,外周為深藍色。白色菌落偶爾也在中央出現(xiàn)一個淡藍色斑點,但其外周無色。互補藍白斑選擇15三、插入失活這種方法只能用于比較老的載體(如pBR322,這些載體帶有兩個或更多個

10、抗生素抗性基因和分布適宜的限制酶切位點。待插入的DNA 及已純化的質(zhì)粒DNA 都用限制酶消化,這些酶的識別位點只位于一個抗生素抗性基因區(qū)內(nèi)。在適宜濃度下將兩個DNA 連接后,用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇對第二種抗生素有抗性的轉(zhuǎn)化體。1617在氨芐青霉素存在下生長的菌落,一些含有重組質(zhì)粒,而另一些可能含有無外源DNA 而在連接過程中自身環(huán)化的質(zhì)粒DNA 。為區(qū)別兩種轉(zhuǎn)化體,用兩種分別含有氨芐青霉素和四環(huán)素的平板,在互相對應(yīng)的位置上,各自接入同一菌落。在四環(huán)素平板中存活并生長的菌落沒有外源DNA 插入。在四環(huán)素平皿中不生長而在氨芐青霉素平板中生長的菌落含有帶失活的ter r 基因的質(zhì)粒,這些質(zhì)?？?/p>

11、能帶有外源DNA 序列。18通過滅活質(zhì)粒所攜帶的抗生素抗性基因來篩選外源DNA 的插入19Figure 4.18. Recombinant selection withpBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.20四、雜交篩選一種在硝酸纖維素濾膜上原位裂解細菌菌落并使釋放出的DNA 非共價結(jié)合于濾膜的方法,結(jié)合于濾膜上的DNA 可與相應(yīng)的放射性標(biāo)記核酸探針進行雜交。是鑒定含目的DNA 的重組質(zhì)粒最常用的技術(shù)。很容易同時篩選數(shù)十萬個細菌菌落,從中找出帶有含靶序列的重組質(zhì)粒的菌落,最

12、后,小量制備質(zhì)粒DNA 進行限制酶切分析和Southern 雜交以證實這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。21固體支持體及其特點:1尼龍膜:最耐用,可以承受幾輪雜交及高溫洗膜操作,可用于不同的探針依次篩選的情況。2Whatman 541濾紙:有很高的濕強度,主要用于篩選一些基因文庫。(保存在微量滴定板各個孔內(nèi)的單菌落復(fù)印菌落轉(zhuǎn)移到濾紙上。裂解、固定,用于雜交。3硝酸纖維素濾膜:與Whatman 541濾紙相比雜交信號較強,更適合常規(guī)的細菌篩選。22現(xiàn)有許多方法可用于放射性探針在溶液中與固定在濾膜上的核酸的雜交,這些方法在以下方面有所不同:1所用的溶劑和溫度(如于68在水溶液中或于42在50%甲酰胺中。2溶劑的體積

13、和雜交的時間(體積大時可長達3天,或體積最小時,短至4小時。3振搖的程度和方法(持續(xù)搖動或固定。4阻斷探針對固相基質(zhì)表面的非特異性吸附的試劑,如Denhardt試劑或BLOTID 。5標(biāo)記探針的濃度及其比活度。6可增進核酸重締合率的化合物,如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇的使用情況。7雜交后洗膜的嚴(yán)格程度。23(一將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上適用于對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(100200進行篩選。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板,和第二個瓊脂平板表面的一張濾膜上。培養(yǎng)一段時間后,對菌落進行原位裂解。主平板貯存于4 直至得到篩選結(jié)果。1在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張濾膜。2用無菌牙簽將各

14、個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。按一定的格子進行劃線接種(或打點,劃出長23mm 的短線。每一菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒(如pBR322的菌落。(陰性對照以區(qū)分放射性標(biāo)記探針與重組質(zhì)粒的特異性退火和非特異性的雜交背景。243倒置平板,于37培養(yǎng).直至劃線的細菌生長達到0.51.0mm 的寬度。4用針頭穿透濾膜直達其下的瓊脂,在硝酸纖維素濾膜3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板相同的位置上也作上標(biāo)記。5用Parafilm 膜封好主平板,倒置貯放于4,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。6裂解細菌,使DNA 結(jié)合于硝酸

15、纖維素濾膜。25(二將菌落影印在硝酸纖維素濾膜上方法一:適用于必須通過雜交來篩選大量菌落時,如用質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA 文庫轉(zhuǎn)化細菌并鋪平板。這時直接用轉(zhuǎn)化混合物將細菌鋪于一張無去污劑的硝酸纖維素濾膜上,然后通過濾膜與濾膜之間的接觸制備影印濾膜。26方法二:適用于同時從瓊脂平板表面把許多細菌菌落轉(zhuǎn)到硝酸纖維濾素膜上。可用于任意大小的菌落,但小菌落(0.10.2mm 效果最佳,與較大的菌落相比,小菌落的雜交信息更清晰,而彌散程度更低。可用此技術(shù)在每張138mm 濾膜上篩選多達2l04個菌落或在每張82mm 濾膜土篩選104個菌落。27操作:1、方法11用一支軟鉛筆或圓珠筆給干的無去污劑的硝酸纖維

16、素濾膜編號,然后用水浸濕,將其夾在于的Whatman 3mm 濾紙中間,用錫箔包裹整疊夾好的濾膜,高壓蒸氣滅菌151bf /in2(1.034x105Pa。準(zhǔn)備足夠的濾膜以便用每個平板制備1張主濾膜和2張影印濾膜。2用無菌平頭鑷子把一張無菌濾膜放到前一天制備的含相應(yīng)抗生素的LB(或SOB瓊脂平板上,編號的一面朝下,當(dāng)濾膜徹底濕潤后,將濾膜從瓊脂平板上剝離,編號的一面朝上放到瓊脂表面上。283將懸于體積較小的液體中的細菌放到位于瓊脂平板表面的濾膜中央。用一無菌的玻璃涂布器均勻地將菌液涂布在濾膜表面,濾膜的邊緣留出23mm 寬的無菌邊界。平板(不倒置半開蓋幾分鐘使接種物蒸發(fā),蓋好,倒置平皿。于37

17、培養(yǎng)至小菌落(直徑0.10.2mm 出現(xiàn)(約810小時。4將濾膜(菌落面朝上轉(zhuǎn)到含相應(yīng)抗生素和25%甘油的LB (或SOB 瓊脂平板上,于37培養(yǎng)2小時。5用Parafilm 膜封好平板,倒置裝在一密閉的塑料袋內(nèi),于-20貯存。于室溫將主平板(仍倒置融化,即可制備影印濾膜。296按下述方法制各影印濾膜:a.事先準(zhǔn)備一疊Whatman 3MM 濾紙(每張濾膜1張,略有富余,切成比濾膜稍大一些,高壓下蒸氣滅菌10分鐘b .從貯存平板剝下主濾膜,菌露面朝上放在濕的無菌3mm 濾紙上。c .將一張濕的無菌硝酸纖維素濾膜編號,放在主濾膜上,注意防止兩張濾膜間留有氣泡。避免濾膜間相互發(fā)生移位。但使它們不致

18、恰好重疊,分離兩張濾膜時會容易些。d.用絲絨影印鋪板器或一個重玻璃平皿(在玻璃和濾膜之間有一張3mm 濾紙將兩張濾膜緊緊地壓在一起。30e. 針頭在兩張濾膜上制作一系列定位標(biāo)記孔。f.分開兩張濾膜,把影印濾膜放到一新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB (或SOB 瓊脂平板上,于37培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落(46小時。g.將主濾膜重新放回一新鮮的合相應(yīng)抗生素和25%甘油的LB (或SOB 瓊脂平板上。于37培養(yǎng)1小時,然后按步驟5進行凍存處理。7裂解細菌,釋放的DNA 結(jié)合到影印濾膜上。維 素 濾 膜 上 的 細 菌 菌 落 用 影 印 鋪 板 器 復(fù) 印 生 長 在 硝 酸 纖 2方法2 方法2 1）直接將細菌懸液

19、鋪于含相應(yīng)抗生素的LB（或SOB）瓊 ）直接將細菌懸液鋪于含相應(yīng)抗生素的LB（ SOB） 脂平板培養(yǎng)表面。將平板半開蓋放在層流式通風(fēng)櫥到瓊 脂表面完全干燥，蓋好平皿倒置放于37培養(yǎng)1214小 脂表面完全干燥，蓋好平皿倒置放于37培養(yǎng)1214小 時。于4放置3060分鐘。 時。于4 放置3060分鐘。 2）用鉛筆或圓珠筆將硝酸纖維濾膜編號。編號的一面超 下，將濾膜放到LB（或SOB）瓊脂培養(yǎng)基表面，與菌落 下，將濾膜放到LB（ SOB） 接觸直到膜完全濕潤。用針頭穿透濾膜和下面的瓊脂作 3個或3個以上的不對稱標(biāo)記。 個或3 3）用平頭鑷子剝離濾膜。 31 32 4）有幾種方法選擇： a.使粘在濾

20、膜上的細菌立即裂解，釋放的DNA結(jié)合于濾膜上。 a.使粘在濾膜上的細菌立即裂解，釋放的DNA結(jié)合于濾膜上。 b.菌落向上使膜放在新配制的含相應(yīng)抗生素的LB（或SOB）瓊脂平 b.菌落向上使膜放在新配制的含相應(yīng)抗生素的LB（ SOB） 板的表面。培養(yǎng)幾小時后細菌長到23mm時可裂解菌落。 板的表面。培養(yǎng)幾小時后細菌長到2 mm時可裂解菌落。 c.可將濾膜轉(zhuǎn)移至含氯霉素（170200ugml）的瓊脂平板上，于 c.可將濾膜轉(zhuǎn)移至含氯霉素（170 200ugml） 37培養(yǎng)12小時（擴增）。在正常情況下，不用擴增，就可以雜 37培養(yǎng)12小時（擴增）。在正常情況下，不用擴增，就可以雜 交檢出克隆化的D

21、NA序列。只有當(dāng)載體可進行松弛型復(fù)制時，才 交檢出克隆化的DNA序列。只有當(dāng)載體可進行松弛型復(fù)制時，才 能進行擴增。 d可用濾膜來制備第二張影印濾膜，使帶菌落的面朝上，將濾膜 放在新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB（或SOB）瓊脂平板表面，然后小 放在新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB（ SOB） 心地將第2張干的硝酸纖維素濾膜放到第1張濾膜上，并與之對準(zhǔn)。 心地將第2 張干的硝酸纖維素濾膜放到第1 將濾膜夾層一起放于37培養(yǎng)數(shù)小時。 將濾膜夾層一起放于37培養(yǎng)數(shù)小時。 （三）菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜 （三）菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜 介紹兩種方法，都應(yīng)盡力避免將任何溶液留在濾膜 的上表

22、面，盡力避免在濾膜下面留有氣泡。 1.方法1： 1.方法1 1）切4張大小及形狀適宜的Whatman 3mm濾紙，端正地放 ）切4 張大小及形狀適宜的Whatman 3mm濾紙，端正地放 于4個玻璃盤或塑料盤的底部，每張3mm濾紙用下面溶液 個玻璃盤或塑料盤的底部，每張3 mm濾紙用下面溶液 中的一種飽和： a.10SDS（可用可不用）。 a.10 SDS（ b.變性液（0.5molL Na0H、1.5molL NaCl）。 b.變性液（0.5mol Na0H、 1.5mol NaCl）。 c.中和液1.5molL Nacl 0.5molL TrisCl c.中和液1.5mol 0.5mol

23、Tris （pH7.4） pH7.4） d2SSC。 SSC。 倒掉任何多余的液體 34 5）于37培養(yǎng)主平板57小時直到菌落再生，用 ）于37培養(yǎng)主平板5 Parafilm膜封好，倒置貯放于4。 Parafilm膜封好，倒置貯放于4 33 2）用平頭鑷子把硝酸纖維素濾膜從平板上剝離下來，菌 落面朝上放于浸過SDS的濾紙上，可以限制質(zhì)粒DNA在變 落面朝上放于浸過SDS的濾紙上，可以限制質(zhì)粒DNA在變 性和中和期間發(fā)生擴散。 3）第1張濾膜在SDS溶液中暴露3分鐘后將其轉(zhuǎn)到第2張用 ）第1 張濾膜在SDS溶液中暴露3 分鐘后將其轉(zhuǎn)到第2 變性液飽和的濾紙上。按順序進行轉(zhuǎn)膜，使之暴露于變 性液5

24、分鐘。 性液5 4）將濾膜轉(zhuǎn)到第3張用中和液飽和的濾紙上，放置5分鐘。 ）將濾膜轉(zhuǎn)到第3 張用中和液飽和的濾紙上，放置5 5）將濾膜轉(zhuǎn)到一張用2SSC飽和的濾紙上，作用5分鐘。 ）將濾膜轉(zhuǎn)到一張用2 SSC飽和的濾紙上，作用5 6）使菌落面朝上，將濾膜放到一張干的濾紙上，于室溫 干燥至少30分鐘。 干燥至少30分鐘。 7）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于80干烤12小時， ）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于80干烤1 以固定DNA 。 以固定DNA 8）將固定好的膜與32P標(biāo)記的探針雜交 35 2方法2： 方法2 1）每一張濾膜，在一包裝膜上制作一個裝有0.5molL ）每一張濾膜，在一包裝膜上制

25、作一個裝有0.5mol NaOH的小 洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到 NaOH的小 洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到 小洼上，展平Saran包裝膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜 小洼上，展平Saran包裝膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜 留于原處23分鐘。 留于原處2 2）用干的紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的Saran ）用干的紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的Saran 包裝和新配制的0.5molL NaOH重復(fù)步驟1）。 包裝和新配制的0.5mol NaOH重復(fù)步驟1 3）再次吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1molL ）再次吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1 mol T

26、risCl （pH7.4）的Saran包裝膜小洼上。5分鐘后， Tris pH7.4） Saran包裝膜小洼上。5 吸干濾膜，用一張新的Saran包裝膜和新的1molL 吸干濾膜，用一張新的Saran包裝膜和新的1 mol TrisCl （pH7.4）重復(fù)該步驟。 Tris pH7.4） 36 6 （四）雜交 4）吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)到新的帶有1.5molL NaCL 0.5mol ）吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)到新的帶有1.5mol L TrisC1（pH7.4）的包裝膜小洼上，5分鐘后，吸 Tris C1（ pH7.4） 的包裝膜小洼上，5 干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，于室溫晾至少20 干濾膜，把它

27、轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，于室溫晾至少20 30分鐘，使濾膜干燥。 30分鐘，使濾膜干燥。 5）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于80干烤2小時，以固 ）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于80干烤2 定DNA。 DNA。 6）將固定在膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交。 將固定在膜上的DNA與 該方案可用于30張直徑為82mm的圓形硝酸纖維素濾膜。可 該方案可用于30張直徑為82mm的圓形硝酸纖維素濾膜。可 根據(jù)雜交反應(yīng)中所用濾膜的數(shù)量和大小適當(dāng)調(diào)整體積。 37 1）盤內(nèi)盛有2SSC，將烤干的濾膜飄浮在液面上，直到 ）盤內(nèi)盛有2 SSC， 濾膜從下到上徹底浸濕。浸泡5分鐘。 濾膜從下到上徹底浸濕。浸泡5

28、2）將濾膜轉(zhuǎn)到一個盛有200ml預(yù)洗液的玻璃皿中，將濾膜 ）將濾膜轉(zhuǎn)到一個盛有200ml預(yù)洗液的玻璃皿中，將濾膜 一張張疊在一起，放于溶液中。用Saran包裝膜蓋住結(jié) 一張張疊在一起，放于溶液中。用Saran包裝膜蓋住結(jié) 晶皿，放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。在這一步及以 后的所有步驟中，應(yīng)緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起， 于50溫育30分鐘。 50溫育30分鐘。 預(yù)洗液： 5SSC 0.5SDS 0.5 38 1mmolL EDTA（pH8.0） 1mmol EDTA（ pH8.0） 3）用泡過預(yù)洗液的紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，這 樣可以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度或清 晰度。

29、4）將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃皿中，在適宜溫 ）將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃皿中，在適宜溫 度（即在水溶液中雜交時用68而在50甲酰胺中雜交 度（即在水溶液中雜交時用68而在50甲酰胺中雜交 時用42）下，溫育12小時。 時用42）下，溫育1 5）將32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100加熱5分鐘，使其變 標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100加熱5 性。迅速將探針放冰浴中冷卻。單鏈探針不必變性。 將探針加入覆蓋濾膜的預(yù)雜交液中，在適當(dāng)溫度下， 溫育直至達到13Cot1/2 雜交期間,盛濾膜的容器應(yīng) 溫育直至達到1 雜交期間, 蓋嚴(yán)以防液體蒸發(fā)。 6）雜交結(jié)束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大 體積（300500ml）的2SSC和0.1SDS溶液中，輕 體積（300500ml） SSC和 0.1 SDS溶液中，輕 輕振搖。在洗膜過程中，至少將濾膜翻轉(zhuǎn)1次。5分鐘 輕振搖