鈣離子濃度在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和β1誘導(dǎo)的體外人卵泡膜細(xì)胞凋亡中的變化

1、    鈣離子濃度在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和1誘導(dǎo)的體外人卵泡膜 細(xì)胞凋亡中的變化        【摘要】目的探討細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)濃度與轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子(TGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF1)誘導(dǎo)的體外人卵泡膜細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法用TGF和TGF1聯(lián)合作用誘導(dǎo)體外無(wú)血清培養(yǎng)的人卵泡膜細(xì)胞發(fā) 生凋亡，利用光鏡、電鏡、瓊脂糖凝膠電泳從形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)方面進(jìn)行凋亡檢測(cè)，用粘附 細(xì)胞分析及篩選激光細(xì)胞儀觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化。結(jié)果TGF和TGF1聯(lián)合作用可引起凋亡的人

2、卵泡膜細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度 升高。結(jié)論Ca2+可能是在TGF和TGF1所致人卵泡膜細(xì)胞 凋亡過(guò)程中參與信號(hào)傳遞的重要因素?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞凋亡卵泡閉鎖人卵泡膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 游離鈣Cytosolic Free Calcium Changes in Apoptotic Human Theca Folliculi Cells Induced by Transforming Growth Factor an 1 in VitroLuo JiaLiu JingXing Fuqi（Armed Police Hospital of Guangdong, Guangzhou 510507）【Abstrac

3、t】ObjectiveTo study the relationship between cytosolic free calcium and apoptosis of human theca folliculi cells induced by Transforming Growth Factor (TGF) plus Tran sforming Growth Factor 1(TGF1).MethodsWe detected human theca folliculi cells apoptosis induced by TGF plus TGF1 i n vitro by means o

4、f optical microscope,electronic microscope and agarose gel ele ctrophoresis,cytosolic free calcium changes in apoptotic human theca folliculi cells by Adherent Cell Analysis and Sorting Interactive Laser Cytometer.ResultsCytosolic free calcium in apoptotic theca folliculi cells induced by TGF plus T

5、GF1 increased apparently compared with control groups.ConclusionThis study shows that cytosolic free calcium may par ticipate the signal regulation during apoptosis of human theca folliculi cells i nduced by TGF plus TGF1.【Key words】ApoptosisFollicular atresiaHuman theca folliculi cellTransforming g

6、rowth f actorFree calcium 目前國(guó)內(nèi)關(guān)于人卵泡膜細(xì)胞凋亡的研究尚屬空白，我們的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明TGF和TGF 1同時(shí)存在可誘導(dǎo)體外無(wú)血清培養(yǎng)的人卵泡膜細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了更深入地了解人卵泡膜細(xì) 胞凋亡的信號(hào)傳遞機(jī)制，本文應(yīng)用粘附細(xì)胞分析及篩選激光細(xì)胞儀觀察凋亡細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度的變化，以期為今后進(jìn)一步研究人卵泡膜細(xì)胞凋亡的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制提供初步的研究資 料。1資料與方法1.1研究對(duì)象本研究病例為10例具有正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌的病人， 年齡3035歲。于 月經(jīng)周期第914天行根治性子宮切除術(shù)時(shí)，從切除的卵巢中采取直徑約15mm卵泡共26個(gè)。 立即置于預(yù)冷的PB

7、S液中。術(shù)中冰凍及術(shù)后病理報(bào)告，10例雙側(cè)卵巢均無(wú)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及病理 性改變。1.2人卵泡膜細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)人卵泡膜細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)參照文獻(xiàn)1，2 進(jìn)行。在無(wú)菌條件下，用眼科剪剪開(kāi)卵泡壁，PBS液緩慢沖洗將顆粒細(xì)胞沖洗出卵泡腔，將 剩余的卵泡剪成1mm×1mm的小塊，置 于含0.25%胰酶和0.02%EDTA和PBS液中37孵育1015分鐘，盡可能去除殘余的顆粒細(xì)胞 ， 然后將組織塊用含1%FBS的PBS液洗2次，用含3g/L膠原酶和5mg/L牛胰腺DNase的PBS孵 育45min，每隔15min用吸管吸棄未消化的組織塊。然后將卵泡膜細(xì)胞懸液用含1%FBS的DMEM 培養(yǎng)基洗3次，重

8、懸于含10%FBS的培養(yǎng)基中，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活，細(xì)胞濃度調(diào)至 每亳升3×105個(gè)，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5ml，37，5%CO2培養(yǎng)。1.3TGF和TGF1誘導(dǎo)體外人卵泡膜細(xì)胞凋亡模型的建立參照文獻(xiàn)，選擇10g/L 作為TGF、TGF1的作用濃度。將培養(yǎng)的卵泡膜細(xì)胞分為4組， 每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，DHank's液洗2遍，換成無(wú)血清培養(yǎng)液。 第13組為實(shí)驗(yàn)組分別加入10g/L TGF、10g/L TGF1、10g/L TGF加10g/L TG F1，第4組為正常對(duì)照組，37，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)后3h、6h、12h、24h，動(dòng)態(tài)觀

9、 察細(xì)胞形態(tài)變化。1.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)3普通光鏡觀察：采用HE染色法。透射電鏡觀察 。生化指標(biāo)檢測(cè)：提取細(xì)胞DNA，進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.5凋亡細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的研究41.5.1單個(gè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化卵泡膜細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，吸去培養(yǎng) 基，DHank's液洗3次，加入50 l20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小時(shí)，DHa nk' s液洗3次，加入0.5ml DHank's液，上粘附式細(xì)胞儀，預(yù)掃描3min。加入TGF及TGF 1，繼續(xù)掃描20min。測(cè)定掃描過(guò)程中Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化。1.5.2不同處理組間細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的差

10、異卵泡膜細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，吸去 培養(yǎng)基，DHank's液洗3次，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入TGF、TGF1、TGF加TGF1 ，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，DHank's液洗3次，加入 50l 20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小時(shí)，DHank's液洗3次，加入0.5ml D Hank's液，上粘附式細(xì)胞儀，測(cè)定各組Ca2+濃度，每組測(cè)定34個(gè)視野，200個(gè) 細(xì)胞。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中所用試劑不含Ca2+，保證無(wú)外源性Ca2+的影響。1.5.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)經(jīng)ACAS 570微機(jī)系統(tǒng)測(cè)量獲得，以±s表示，將三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組進(jìn)

11、行均數(shù)間兩兩比較。2結(jié)果2.1TGF和TGF1作用后卵泡膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化2.1.1HE染色光鏡觀察結(jié)果培養(yǎng)2小時(shí)后的卵泡膜細(xì)胞，加入TGF加TGF1后，約3小 時(shí)細(xì)胞體積開(kāi)始縮小，12小時(shí)部分細(xì)胞變圓、上浮，隨時(shí)間推移上浮細(xì)胞增多，24小時(shí)將爬 片生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)HE染色，光鏡下觀察可見(jiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)收縮 、深染，呈淡紅色，核染色質(zhì)濃縮，呈藍(lán)黑色，聚集于核膜下呈境界分明的顆粒塊狀小體， 可見(jiàn)部分細(xì)胞膜出泡以及細(xì)胞膜包裹碎裂的核而成的凋亡小體，而TGF和TGF1單獨(dú)處理 無(wú)此作用。2.1.2透射電鏡觀察結(jié)果電鏡下觀察到正常卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞核為卵圓形，胞質(zhì)中滑面 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，

12、線粒體豐富，嵴多呈管狀，高爾基復(fù)合體及脂滴廣泛分布。而本研究TGF加T GF1誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞形態(tài)呈染色質(zhì)濃縮，聚集于核膜下呈境界分明的塊狀或月形小體，細(xì) 胞漿濃縮或細(xì)胞核裂解成質(zhì)膜包繞的碎片，細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)完整的細(xì)胞器。2.2TGF和TGF1作用后卵泡膜細(xì)胞凋亡的生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果體外培養(yǎng)的卵泡膜細(xì)胞 經(jīng)TGF、TGF1、TGF加TGF1作用24小時(shí)后，提取細(xì)胞總DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從譜可以看出經(jīng)TGF加TGF1作用后的細(xì)胞DNA譜為180200bp 及其倍數(shù)的片段，呈梯子狀(ladder)，而單獨(dú)作用的細(xì)胞其DNA譜不呈現(xiàn)梯狀帶。說(shuō)明經(jīng)T GF加TGF1作用后卵泡膜細(xì)胞DNA在核小體連接部

13、位發(fā)生了斷裂。2.3TGF和TGF1誘導(dǎo)的凋亡卵泡膜細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化2.3.1卵泡膜細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化熒光標(biāo)記后，ACAS 570開(kāi)始動(dòng)態(tài)掃 描 。以處理前預(yù)掃描所測(cè)得的值為基數(shù)1，掃描全過(guò)程中所得熒光值與預(yù)掃描熒光值的比值則 代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的相對(duì)熒光值。本研究結(jié)果，負(fù)荷TGF加TGF1后，熒光值迅 速升 高，于負(fù)荷后70s達(dá)峰值為3.4，之后開(kāi)始下降，第300s降至2.95時(shí)出現(xiàn)一平臺(tái)期，第500s 時(shí)又下降，第900s時(shí)降至2.0，熒光值為負(fù)荷前基值水平的2倍。2.3.2不同處理組間卵胞膜細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的差異TGF組、TGF 1組、TGF加TGF1組

14、及對(duì)照組的卵泡膜細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度由ACAS 570測(cè)定，每組 測(cè)定34個(gè)視野，200個(gè)細(xì)胞，熒光值結(jié)果以±s表示，見(jiàn)表1 。表1各組TGF和TGF1作用后細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃 度的熒光值組別細(xì)胞數(shù)±s對(duì)照組280371.32±3.58TGF484388.33±5.26TGF1267362.33±4.36TGF+TGF1173417.35±2.211)注：1)與對(duì)照組相比，P0.01 由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，TGF組與TGF1組Ca2+濃度無(wú)明 顯差異(P0.2)，TGF加TGF1組Ca2+濃度顯著升高(P0.01)，表明T

15、G F 和TGF1聯(lián)合作用能引起卵泡膜細(xì)胞漿游離Ca2+濃度升高，而單獨(dú)作用對(duì)Ca2+ 濃度沒(méi)有影響。3討論大量的研究證明，細(xì)胞內(nèi)適宜的Ca2+可能通過(guò)活化Ca2+依賴的內(nèi)切核酸酶 激發(fā)DNA的降解，Ca2+鈣調(diào)素依賴性蛋白磷酸化酶的激發(fā)也與觸發(fā)細(xì)胞凋亡過(guò)程有 關(guān)5，另外，Ca2+與細(xì)胞骨架的磷酸化和去磷酸化密切相關(guān)，造成凋亡細(xì) 胞的皺縮、變形、膜出泡等一系列形態(tài)學(xué)改變，最終死亡6。細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度被認(rèn)為是參與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機(jī)制 7。在卵泡閉鎖的過(guò)程中，顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞相繼以凋亡的形式消退8 。 許多致凋亡因素可引起凋亡細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升

16、高，如一些物理因素、毒性因子、細(xì) 胞因子、病毒感染及免疫相關(guān)機(jī)制的作用。這些凋亡過(guò)程常伴有凋亡的重要生化標(biāo)志即染色 質(zhì)的有控降解，DNA在核小體連接部位斷裂為180200bp的亞單位片段或其倍數(shù)的片段，其 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯形譜，此過(guò)程被認(rèn)為與內(nèi)源性Ca2+、Mg2+依賴性內(nèi)切 酶(endonuclease)有關(guān)5；Arend等還認(rèn)為，內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶有選擇地被活化 不 僅與DNA的有序斷裂有關(guān)，且是凋亡時(shí)細(xì)胞核形態(tài)變化的重要原因6。目前對(duì)凋亡 過(guò)程中的關(guān)鍵內(nèi)切核酸酶的定性和提取仍是困難的，原因在于活化過(guò)程中酶的不穩(wěn)定性及 在眾多凋亡例子中被活化的候選內(nèi)切酶的多樣性。另外，依賴于Ca2+的酶

17、還有鈣蛋白 酶(calpain)和谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(transglutaminase)，它們被認(rèn)為分別與細(xì)胞骨架紊亂與細(xì)胞 皺縮、胞漿蛋白質(zhì)交聯(lián)和維持凋亡小體完整、防止細(xì)胞內(nèi)涵物外溢等有關(guān)。Bennett9 等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)對(duì)于凋亡的細(xì)胞被 周圍的細(xì)胞識(shí)別及吞噬清除是必不可少的，此過(guò)程也是Ca2+依賴的。另外，Ca2+ 還能激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，后者有改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，使聚合的核小體 松懈，減弱組蛋白DNA相互接觸，以使DNA更易被核酸內(nèi)切酶接近?？梢?jiàn)，胞漿內(nèi)Ca2+ 的濃度變化是凋亡發(fā)生的重要信號(hào)機(jī)制之一。然而，

18、有一些凋亡的發(fā)生過(guò)程，卻并不依賴 于Ca2+濃度的增加，且細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的活化不被Ca2+激活，而是為Zn 2+所抑制10。事實(shí)上，胞內(nèi)Ca2+增加可導(dǎo)致增殖和凋亡雙重改變，其最 終指向取決于 次級(jí)信號(hào)的有無(wú)，若Ca2+增加，未被激活，則不能抑制Ca2+和(或)PKC對(duì)核酸 內(nèi) 切酶的激活作用，造成DNA降解，細(xì)胞凋亡；反之，若PKC被激活則凋亡途徑被抑制，細(xì)胞呈 現(xiàn)增殖狀態(tài)。這種一個(gè)信號(hào)調(diào)節(jié)兩種相反過(guò)程的現(xiàn)象，體現(xiàn)了細(xì)胞功能調(diào)控中的節(jié)約機(jī)制， 也為細(xì)胞在不同環(huán)境條件下不同的狀態(tài)提供了解釋。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用粘附細(xì)胞分析儀及篩選激光細(xì)胞儀觀察了TGF和TGF1聯(lián)合作用誘導(dǎo)卵泡膜 細(xì)胞凋亡后胞內(nèi)游離C

19、a2+濃度的變化。ACAS 570是一種比較簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)培養(yǎng)細(xì) 胞內(nèi)游離Ca2+的方法，既可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，又可反應(yīng)細(xì) 胞形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所用的熒光探針是Ca2+螯和劑EGTA的衍生物，對(duì)Ca2+有較高的 特異性親和力，其本身不能透過(guò)細(xì)胞膜，將其接一個(gè)酯性基團(tuán)AM后才能導(dǎo)入細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞 內(nèi)的非特異性酯酶水解該酶鏈，釋放出Fluo3，F(xiàn)luo3與胞漿Ca2+結(jié)合后可 被488nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，其熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定卵泡 膜 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及其變化。結(jié)果表明，TGF和TGF1聯(lián)合作用可使胞漿內(nèi)Ca2+ 濃度快速升高，說(shuō)明Ca2+參與了TGF

20、和TGF1誘導(dǎo)的體外人卵泡膜細(xì)胞凋亡的信 號(hào)傳遞過(guò)程。這僅提供了一個(gè)初步的研究成果，其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制還有待繼續(xù)深入研究。本課題由國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào) 39670756)資助作者單位：羅嘉（武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院婦 產(chǎn)科廣州，510507）劉菁（第一軍醫(yī)大學(xué)分子免疫研究所廣州，510515）邢福祺（第一軍醫(yī)大學(xué)南方 醫(yī)院婦產(chǎn)科廣州，510515）參考文獻(xiàn)1，Lobb DK,Skinner MK,Dorrington JH.Rat thecal/interstitial cells produce amitogenic activity that promotes the growth of gran

21、ulosa cells:molecular and c ellular.Endocrinology,1988;55:2092，Christina B,Olsson JH.Regulation of androgen production in cultured hu man thecal cells by insulinlike growth factor and insulin.Fertil Steril,199 3;59:3233，姜泊，周殿元.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京：人民軍醫(yī)出版社，1996：171 4，張薇，樸英杰，鮑永耀，等.粘附式細(xì)胞儀測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣的方法.第一 軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994；14(1)：435，Wyllie AH,Arends MJ,Morris RG,et al.The apoptosis endonuclease and its regulation.Semin Immunol,1992;4:3896，Lemaster JJ,Diguiseppi J,Mieminen A,et al.Blebbing free Ca2+ and mi