黃芪注射液對basallike型乳腺癌細(xì)胞MDAMB468增殖的影響

1、黃芪注射液對basallike型乳腺癌細(xì)胞MDAMB468增殖的影響         09-08-13 15:50:00     作者：葉媚娜, 陳紅風(fēng)    編輯：studa20【摘要】  目的：觀察黃芪對basallike乳腺癌細(xì)胞MDAMB468和小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（murine bone marrow stromal stem cells, mMSCs）增殖的影響及其異同。方法：用不同濃度的黃芪注射液（Astragal

2、us injection, AI）分別干預(yù)MDAMB468和mMSCs，不加AI培養(yǎng)2 d的MDAMB468細(xì)胞作為空白對照。用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit8, CCK8）檢測AI對MDAMB468的細(xì)胞毒性作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測AI對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。酶比色法監(jiān)測 MDAMB468細(xì)胞培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測AI對MDAMB468表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p

3、53蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：1 g/ml AI對MDAMB468的增殖有明顯的抑制作用，且具有時(shí)效關(guān)系。1 g/ml AI對mMSCs的增殖有明顯的抑制作用，但其抑制作用不及順鉑，而0.1 g/ml AI對mMSCs的增殖有明顯的促進(jìn)作用。不同濃度的AI能誘導(dǎo)MDAMB468細(xì)胞凋亡。不同濃度AI組和順鉑組MDAMB468細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH水平，與空白對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AI能顯著下調(diào)EGFR和p53蛋白的表達(dá)。結(jié)論：AI對MDAMB468和mMSCs增殖的影響與藥物濃度有關(guān)，其抑制MDAMB468增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能通過下調(diào)EGFR和p53蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】

4、0; 黃芪注射液; 乳腺癌; MDAMB468細(xì)胞; 細(xì)胞增殖; 小鼠Objective: To investigate the effects of Astragalus injection (AI) on basallike breast cancer cell line MDAMB468 and murine bone marrow stromal stem cells (mMSCs).Methods: MDAMB468 cells and primary cultured mMSCs were treated by different concentrations of AI, and

5、 with untreated MDAMB468 cells as blank control. The morphology of cells was observed by phasecontrast inverted microscope and transmission electron microscopy. Cytotoxic effects of AI on MDAMB468 cells and mMSCs were evaluated by cell counting kit8 (CCK8) assay. Cell cycle and apoptosis of MDAMB468

6、 cells induced by AI were measured by flow cytometry. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was measured by enzymatic colorimetric method. The expressions of epidermal growth factor receptor (EGFR) and p53 protein in MDAMB468 cells were evaluated by streptavidinbiotinperoxidase comple

7、x method.Results: A timedependent cytotoxic effect of 1 g/ml AI was observed in MDAMB468 cells. 1 g/ml AI also had cytotoxic effect on mMSCs, but its effect was not better than cisplatin. 0.1 g/ml AI could promote the proliferation of mMSCs. Different concentrations of AI could all induce the apopto

8、sis of MDAMB468 cells. There was no significant difference in LDH activity in the supernatants between blank control group and AItreated and cisplatintreated groups. AI could downregulate the expressions of EGFR and p53 protein.Conclusion: The effects of AI on MDAMB468 cells and mMSCs are related to

9、 the concentration of AI, and its mechanism of inhibiting the proliferation of MDAMB468 cells may be due to downregulation of the expressions of EGFR and p53 protein.Keywords: Astragalus injection; breast cancer; MDAMB468 cells; cell proliferation; mice    乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率持續(xù)上

10、升，尤其北京、上海等大城市女性乳腺癌發(fā)病率已列居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，并呈現(xiàn)出發(fā)病年齡年輕化的趨勢1。根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progestin receptor, PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor2, HER2）的表達(dá)，國際上將乳腺癌劃分為luminal A、luminal B、HER2過表達(dá)、basallike和normal breastlike等亞型2，3。其中basallike型乳腺癌短期內(nèi)容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存期較短，患者年齡偏低，除手術(shù)和放化療外，不適合使用

11、內(nèi)分泌治療，也無其他有效的治療手段4，這已成為目前臨床治療的難點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。因此，中醫(yī)藥干預(yù)在該亞型乳腺癌的綜合治療中就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過觀察黃芪對basallike乳腺癌細(xì)胞MDAMB468的增殖、細(xì)胞周期和凋亡以及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p53蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)材料1.1.1  細(xì)胞株 Basallike型乳腺癌細(xì)胞株MDAMB468購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。1.1.2  藥物及試劑

12、 黃芪注射液（Astragalus injection, AI）（批號：0611121），10 ml/支，每支相當(dāng)于含生藥20 g，購自正大青春寶藥業(yè)有限公司；順鉑注射液（批號：S081881），1 mg/ml，購自澳大利亞F. H. Faulding & Co. Ltd. Trading as David Bull；胎牛血清（批號：560553）、L15培養(yǎng)基（批號：1300873）和McCoys 5A培養(yǎng)液（批號：1329702）均購自美國Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit8, CCK8）（批號：VX749）購自日本同仁化學(xué)研究所；p53抗

13、體（批號：200703）和EGFR抗體（批號：200703）均購自武漢博士德生物工程有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）底物試劑盒（批號：200608）購自上海長島生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測試劑盒（批號：68363901）購自中國羅氏公司；Triton X100、碘化丙啶（propidium iodide, PI）、RNase酶由上海腫瘤醫(yī)院乳腺實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞室提供。1.1.3  實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（Heraeus），熒光倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)

14、），Thermo Labsystems Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀，F(xiàn)acscalibour流式細(xì)胞儀（BD Bioscience）、Philips CM120透射電子顯微鏡和日立7170s全自動生化分析裝置。1.2  實(shí)驗(yàn)方法1.2.1  CCK8法檢測AI干預(yù)MDAMB468細(xì)胞的量效和時(shí)效關(guān)系  取對數(shù)生長狀態(tài)良好的MDAMB468細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104/ml，以每孔5×103的量接種于96孔板，待細(xì)胞生長基本融合后加入AI，使其終濃度分別達(dá)到含生藥量1 g/ml、0.1 g/ml和0.01 g/m

15、l。同時(shí)另設(shè)調(diào)零孔和陰性對照孔。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。于作用2 d后，每孔加培養(yǎng)液100 l、CCK8溶液10 l，37 孵育2 h。應(yīng)用MK3酶標(biāo)儀，于波長450 nm處測得每孔的吸光度（absorbance, A），檢測量效關(guān)系。另以AI終濃度分別為1 g/ml和0.1 g/ml含藥培養(yǎng)液作用1、2、3、4、5、6和7 d時(shí)測定每孔的A值，隔日更換培養(yǎng)液。檢測時(shí)效關(guān)系。1.2.2  透射電子顯微鏡下觀察MDAMB468細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，將終濃度為1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用細(xì)胞2 d后，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞后，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心15 min，棄上清，緩緩加入4 預(yù)冷的2%戊二醛固定1 h。1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成50 nm超薄切片，經(jīng)3%醋酸鈾枸櫞酸鉛雙染色后在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。以不加AI培養(yǎng)2 d的MDAMB468細(xì)胞作為空白對照。1.2.3  流式細(xì)胞術(shù)檢測MDAMB468的細(xì)胞周期和凋亡  取對數(shù)生長期細(xì)胞，將終濃度為1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用細(xì)胞2 d后，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1