DNA膠回收常見問題

1、 DNA膠回收中常見問題分析 DNA膠回收中常見問題分析1、如何計算提取率？1) 回收前樣品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用測回收前后吸光度的的方法計算回收率；2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進行電泳條帶灰度對比；3) 注意，電泳條件及拍攝條件將對灰度對比結(jié)果造成很大影響，請仔細操作，以減小誤差。2、如何簡易測算提取率？ 取膠回收后的DNA溶液體積的1/51/10，與等體積的回收前的DNA溶液的510倍稀釋液一起電泳，肉眼觀察回收后的條帶相對于回收前條帶的亮度，粗略測算回收率（如亮度只有一半時，其回收率可粗略為50%）。

2、 3、如何看待提取得率？影響回收率的因素很多，如DNA片段大小、點樣量、凝膠種類、電泳緩沖液的緩沖能力、切膠操作、紫外燈照射強度和時間、溶膠是否徹底等等，所以不能單憑1-2次的實驗來判斷其質(zhì)量好壞，最好是多做幾次實驗或用幾種不同品牌的產(chǎn)品做平行對照實驗，結(jié)果相對真實。 4、回收率為什么與點樣量和片段大小有關(guān)？DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強，就越難洗脫，回收率就低；DNA的量越少，相對損失越大，回收率越低。5、用膠回收試劑盒從凝膠中回收DNA得率低是什么原因？1） 膠塊溶解不完全，可適當延長水浴時間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例；2） 膠塊體積太大，應(yīng)使用槍頭搗碎，還不能充分溶解則

3、先將其切為小塊，分多次回收；3） 紫外燈下切膠時間過長，導(dǎo)致DNA部分降解，應(yīng)盡量把切膠時間控制在30s以內(nèi)；4） 洗滌液使用后未及時蓋嚴瓶蓋，乙醇揮發(fā)，影響回收效率；5） TAE或TBE電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導(dǎo)致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，應(yīng)及時更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好。6） 回收前的樣品量太少，加大點樣量7） 洗脫前，預(yù)先65預(yù)熱洗脫液、延長室溫靜置時間、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。6、加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？ 1） 膠塊溶解不充分，可再補加一些溶膠液或延長水浴時間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠； 2

4、） 膠塊體積過大，應(yīng)盡量切除多余部分，并將其切為小碎塊，分幾次回收； 3） 水浴溫度是否達到規(guī)定溫度65，用溫度計檢測。7、瓊脂糖凝膠塊不溶？ 1） 瓊脂糖質(zhì)量不好; 2） 含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久，使膠塊失水干躁，建議切膠后立即進行回收或?qū)⒛z塊保存于4 或-20； 3） 制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。8、點樣時發(fā)現(xiàn)DNA樣品有漂出點樣孔外的現(xiàn)象？柱子上的乙醇未完全揮發(fā)干凈，延長室溫下空柱靜置時間以確保乙醇完全揮發(fā)干凈。9、能否使用去離子水洗脫回收？可以，但是實驗室所用去離子水一般PH值偏低，可用NaOH適當調(diào)高PH值7.0，以增加回收得率。10、能否使用TE（PH8.0）洗脫？可以

5、11、可否使用小于30l的洗脫液進行洗脫？不可以。因為說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積。12、關(guān)于DNA片段大小與回收率的問題？ 100bp-500bp，30-60%；500bp-4kb，80-95%；4kb以上，30-50%。13、OD值與瓊脂糖凝膠中的DNA產(chǎn)量不相符？從柱子上洗脫下來的痕量雜質(zhì)增加了A260的值14、吸光度純度測定時應(yīng)注意的問題吸光度測量的是未知樣品與調(diào)零標準之間的相對吸光度，所以請用與洗脫液體相同的液體，對測量樣品進行稀釋和調(diào)零。15、為什么溶膠不徹底會影響回收結(jié)果的純度？在電泳過程中，DNA會與大分子的多糖緊密的結(jié)合在一起，凝膠的種類和質(zhì)量不同，DNA與之結(jié)合力也不同，只有凝膠充分溶解，DNA才能充分釋放，否則，凝膠將與DNA一起沉淀下來，洗脫后將影響回收結(jié)果的純度。 廣州市珀爾生物科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)地址：深圳市龍崗區(qū)龍坪西路