DNA提取中實驗試劑作用與原理(精)

1、1溶液 I溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分 肽聚糖中的 3-1,4 糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中 pH 小于 8 時，溶菌酶作用 受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓,防止 DNA 受機械剪切力作用而降 解。EDTA:(1 螯合 Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對 DNA 的降解作 用(DNase 作用時需要一定的金屬離子作輔基;(2EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用, 因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。2 溶液 11-NaOH-SDS 液:NaOH:核酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中，是穩(wěn)定的。 但當 pH12

2、 或 pH3 時,就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液 II 中的 NaOH 濃度為 0.2mo1/L,加抽提液時，該系統(tǒng)的 pH 就高達 12.6,因而促使染色體 DNA 與質(zhì)粒 DNA的變性。3.SDS:SDS 是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1 溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋 白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。(2 解聚細胞中的核蛋白。(3SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié) 合成為R-O-SO3 R+-蛋白質(zhì)的復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是 SDS 能抑 制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操 作中仙RNase 去除 RNA 時受到干擾。3. 溶液 lll-3

3、mol/L NaAc(pH4.8 溶液:NaAc 的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié) pH 至 4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所 以該溶液實際上是 NaAc-HAc 的緩沖液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是為了把 pH12.6 的抽提液調(diào)回 pH 至中性，使變性的質(zhì)粒 DNA 能夠復性,并能穩(wěn)定存在。而高鹽的 3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白復合物凝聚而 沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與 SDS -蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。4. 為什么用無水乙醇沉淀 DNA?用無水乙醇沉

4、淀 DNA,這是實驗中最常用的沉 淀DNA 的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學 反應，對 DNA 很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA 溶液是 DNA 以水合狀態(tài)穩(wěn)定存 在,當加入乙醇時，乙醇會奪去 DNA 周圍的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般實 驗中，是加2 倍體積的無水乙醇與 DNA 相混合，其乙醇的最終含量占 67%左右。 因 而也可改用 95%乙醇來替代無水乙醇 （因為無水乙醇的價格遠遠比 95%乙醇昂貴。 但是加 95%的乙醇使總體積 增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 損失也增大，尤其用多次乙醇沉 淀時，就會影響收得率。

5、折中的做法是初次沉淀 DNA 時可用 95%乙醇代替無水乙酵 最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6 倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置 15-30 分鐘即可。5. 在用乙醇沉淀 DNA 時,為什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最終濃度達0.10.25mol/L?在 pH 為 8 左右的溶液中，DNA 分子是帶負電荷的，加一定濃度的 NaAc或 NaCl,使 Na+中和 DNA 分子上的負電荷，減少 DNA 分子之間的同性電荷相 斥力,易于互相聚合而形成 DNA 鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分 DNA 形成 DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成 DNA 沉淀不完

6、全，當加入的鹽溶液濃度太 高時,其效果也不好。在沉淀的 DNA 中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響 DNA 的酶切等 反應,必須要進行洗滌或重沉淀。6. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用 SDS 與 KAc 來處理？加進去的RNase 本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化 DNA,又必須去除之，加 SDS 可使它們成為 SDS- 蛋白復合物沉淀，再加 KAc 使這些復合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase.在溶 液中,有人以 KAc 代替 NaAc,也可以收到較好效果。7為什么在保存或抽提 DNA 過程中，一般采用 TE 緩沖液？在基因操作實驗中 選 擇緩沖液的主要原則是考慮 DNA 的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽 緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2 和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24 等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍 （pH,可作 DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與 Ca2 + 產(chǎn)生Ca3(PO42 沉淀;在 DNA 反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要 求高