實(shí)時(shí)熒光PCR和RT-PCR方法檢測(cè)登革病毒的比較研究

1、實(shí)時(shí)熒光PCR和RT-PCR方法檢測(cè)登革病毒的比較研究作者：劉建軍，古麗巴哈爾，陽(yáng) 帆，陳家敏，何雅青，楊 洪【摘要】 目的 通過(guò)2種檢測(cè)登革病毒方法的比較，以提高檢測(cè)登革病毒的靈敏度和特異性。方法 利用Taqman MGB技術(shù)，根據(jù)登革病毒3端非編碼區(qū)的一段高度保守序列，設(shè)計(jì)登革14型熒光PCR通用引物和TaqmanMGB探針，以登革熱毒株作為標(biāo)準(zhǔn)，以乙腦毒株作對(duì)照，建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)登革病毒的快速方法。并對(duì)10份ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性的臨床血清標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR及熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)10份臨床血清標(biāo)本，2份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)登革病毒與乙腦病毒無(wú)交

2、叉反應(yīng)，檢測(cè)10份臨床血清標(biāo)本，5份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50。從RNA提取到檢測(cè)結(jié)果僅需4h。結(jié)論 Taqman MGB實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，可作為登革病毒的快速檢測(cè)方法，應(yīng)用于登革熱的臨床早期診斷?！娟P(guān)鍵詞】 登革病毒；RT-PCR；Taqman GMB實(shí)時(shí)PCR【Abstract】 Objective In order to improve the sensitivity and specificity of detecting dengue viruses， two methods for detecting dengue viruses were compared.Me

3、thods Using Taqman MGB technique， a pair of universal primers and Taqman MGB probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were used as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control， the

4、real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue viruses was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results There was no cross-reaction with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens， 2 was positive by RT-PCR a

5、nd 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 hours.Conclusion The Taqman MGB real-time PCR assay was fast， sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosis of dengue viruses.【Abstract】 dengue virus；RT-PCR；Taqman GMB real-time PCR登革熱是流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一種急性蟲(chóng)媒傳

6、染病，其病原體為登革病毒，近年來(lái)隨著全球氣候變暖和國(guó)際旅游的增多，登革病毒感染呈擴(kuò)大蔓延之勢(shì)，發(fā)病率不斷升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此對(duì)該疾病實(shí)行早期診斷十分必要。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬， 為單股正鏈病毒，基因組長(zhǎng)約11。依抗原性不同分為1、2、3、4四個(gè)血清型(14)1，2。登革病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，傳統(tǒng)方法是從患者血清中分離病毒，或用血清學(xué)方法檢測(cè)病毒的特異性抗體。但病毒分離費(fèi)時(shí)，檢測(cè)血清抗體需分別在患者感染的急性期及恢復(fù)期采集雙份血清， 同時(shí)存在廣泛的交叉反應(yīng)而受到干擾3，這些均不利于疾病的早期診斷。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)登革熱病毒4，但RT-PCR方法

7、容易造成污染，同時(shí)也存在從臨床血清標(biāo)本中檢測(cè)登革病毒敏感性不夠的問(wèn)題。這就需要建立一種更敏感、特異和快速的檢測(cè)鑒定方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)登革熱患者的早期快速診斷，為預(yù)防控制登革熱的流行贏得時(shí)間。本研究比較了利用TaqmanMGB探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR和RT-PCR方法檢測(cè)登革病毒特異性，以期選擇特異性好、靈敏度高的檢測(cè)方法，達(dá)到快速診斷登革熱的目的。1 材料與方法1.1 毒株及血清標(biāo)本 登革病毒14型標(biāo)準(zhǔn)株由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強(qiáng)毒株由成都生物制品所提供。血清標(biāo)本采自深圳市近幾年發(fā)病2周內(nèi)的疑似登革熱病人和發(fā)病10天內(nèi)的疑似乙腦病人，-80保存。1.2 主要試劑 病毒

8、RNA提取試劑盒為Roche公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、隨機(jī)引物購(gòu)自Invitrogen公司，dNTP購(gòu)自上海生工公司， AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNaseinhibitor購(gòu)自大連寶生物公司，引物和熒光探針由上海基康生物技術(shù)有限公司合成及標(biāo)記，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。1.3 主要儀器設(shè)備 Centrifuge 5415D臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司， Ultrospec 2000紫外可見(jiàn)光蛋白核酸分析儀購(gòu)自美國(guó)GE公司， 9700基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，Gene Genius凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene公司， Mx4000熒光PC

9、R儀購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。1.4 引物及探針設(shè)計(jì) 在GeneBank上檢索登革病毒4個(gè)血清型中都一致的高度保守序列，根據(jù)登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，設(shè)計(jì)登革14型RT-PCR通用引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為511bp。根據(jù)DEN 3端非編碼區(qū)的一段高度保守序列，設(shè)計(jì)登革14型熒光PCR通用引物和Taqman探針，探針5用FAM報(bào)告熒光基團(tuán)標(biāo)記，3用MGB淬滅熒光基團(tuán)標(biāo)記，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為68bp。登革病毒RT-PCR通用引物：Den-D1： 5 TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG3Den-D2： 5 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCA

10、GGTTC3登革病毒熒光PCR通用引物：Den-FP： 5 GCATATTGACGCTGGGAGAGA3Den-RP： 5GGCGTTCTGTGCCTGGAAT3登革病毒通用探針：Den-Probe：5 FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB3引物和探針均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成及標(biāo)記。1.5 病毒RNA提取 14型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株用1640培養(yǎng)液溶解，接種C6/36細(xì)胞，傳代次，按病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取病毒RNA，RNA置-80保存?zhèn)溆谩?.6 反轉(zhuǎn)錄及普通PCR1.6.1 RNA逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)總體積為20l，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：5緩沖液5l，2.5mmol/L 4

11、dNTP 1l，0.3g/l Random（Invitrogen公司生產(chǎn)）引物1l，提取的RNA 12l，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10u/l）1l混勻。反應(yīng)條件為：42 60min95加熱5min4保存。然后將產(chǎn)物放置于-20備用。1.6.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)總體積為20l，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：10緩沖液2l，2.5mmol/L，4dNTP 1l，25mmol/LMgCl2 2.5l，通用引物D1、D2（5mol/L）各1l，RT產(chǎn)物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清標(biāo)本，陰性對(duì)照），Taq酶（5u/l） 0.25l，加H2O補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為：94 5min94 30s，60 30s，72 3

12、0s，循環(huán)40次72延伸10min4保存。1.6.3 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析 配制含溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取10lPCR產(chǎn)物電泳，在凝膠成像儀上觀察并照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.7 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)總體積為25l，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：10緩沖液2l，10mmol/L 4dNTP 0.75l，50mmol MgCl2/L 2.5l，引物Den-FP，Den-RP（10mol/L）各0.5l，探針Den-probe（5mol/L）0.6l，RT產(chǎn)物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清標(biāo)本，陰性對(duì)照），Taq酶（5u/l）0.25l，加H2O補(bǔ)足25l體系。反應(yīng)條件是：50 2min95 10min

13、95 30s60 30s，循環(huán)40次4保存。采用MX4000實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，延伸階段檢測(cè)熒光。2 結(jié)果2.1 普通RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 14型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株、10份發(fā)病2周內(nèi)疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG檢測(cè)為陽(yáng)性，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強(qiáng)毒株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，在511bp處14型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株都出現(xiàn)了目的基因條帶，10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出現(xiàn)目的基因條帶，其他標(biāo)本都為陰性，見(jiàn)圖1。說(shuō)明此RT-PCR檢測(cè)體系具有良好的特異性。注： DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；14分別為型登革毒株；513血清標(biāo)本（其中5和8為同一標(biāo)本）；14、15為乙腦病毒對(duì)照；-為空白

14、對(duì)照?qǐng)D1 登革型毒株和血清標(biāo)本PCR擴(kuò)增結(jié)page_break果2.2 登革病毒Taqman MGB PCR體系檢測(cè)結(jié)果2.2.1 有效性檢驗(yàn) 按1.7方法，分別提取登革病毒14標(biāo)準(zhǔn)株RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的實(shí)時(shí)PCR，14型均觀察到熒光信號(hào)增強(qiáng)。2.2.2 特異性分析 登革病毒14標(biāo)準(zhǔn)株、乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強(qiáng)毒株經(jīng)TaqmanMGB體系檢測(cè)，只有登革病毒14標(biāo)準(zhǔn)株觀察到熒光信號(hào)增加外，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強(qiáng)毒株均沒(méi)有熒光增加信號(hào)，見(jiàn)圖2。這證明了此TaqmanMGB檢測(cè)體系的特異性。2.2.3 登革病毒TaqmanMGB PCR檢測(cè)體系的應(yīng)用 用型登革病毒作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)10份發(fā)病2周

15、內(nèi)疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG檢測(cè)為陽(yáng)性，8份發(fā)病10天內(nèi)疑似乙腦病毒感染病人血清作為對(duì)照，其IgM、 IgG檢測(cè)為陽(yáng)性。進(jìn)行TaqmanMGB PCR檢測(cè)，結(jié)果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出現(xiàn)熒光信號(hào)增加，其他血清標(biāo)本均無(wú)熒光信號(hào)。見(jiàn)圖3。注：1、2、3、4分別為、登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株圖2 登革病毒熒光PCR特異性分析注：1：型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株；26：疑似登革病毒感染病人血清標(biāo)本圖3 血清標(biāo)本熒光PCR檢測(cè)結(jié)果3 討論Taqman探針是一條與病原體核酸特異性結(jié)合的熒光素標(biāo)記探針，它的結(jié)合位點(diǎn)位于普通PCR的2條引物之間5。探針的5端和3端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，PCR

16、擴(kuò)增在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí)， Taq酶發(fā)揮它的53的外切酶功能，將探針切成單核苷酸，5端發(fā)出的熒光信號(hào)不再被3端所吸收而能被儀器檢測(cè)到。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此，隨著PCR產(chǎn)物的不斷增加，儀器所檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)。當(dāng)標(biāo)本中不含病原體時(shí)，PCR反應(yīng)不發(fā)生，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，其擴(kuò)增曲線為一水平線。TaqmanMGB探針是在Taqman原理基礎(chǔ)上提出的6。TaqmanMGB探針的突出優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、步驟簡(jiǎn)單，提高了配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異，由于在探針

17、的3端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報(bào)告基團(tuán)在空間位置更接近，使雜交的穩(wěn)定性和重復(fù)性大大提高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高。筆者在TaqmanMGB技術(shù)基礎(chǔ)上，建立了實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)14型登革病毒的方法。上述研究結(jié)果表明：（1）本檢測(cè)方法可靠性好、敏感性高，比普通PCR方法靈敏度提高30%，可檢測(cè)發(fā)病10天內(nèi)的臨床血清標(biāo)本，而傳統(tǒng)的登革病毒分離方法要求發(fā)病5天內(nèi)的標(biāo)本，才有可能分離出陽(yáng)性。（2）特異性強(qiáng)，收集熒光在較高的退火溫度(60)進(jìn)行，排除了模板的非特異性擴(kuò)增，同時(shí)，與容易造成血清學(xué)交叉反應(yīng)的乙腦病毒及其臨床標(biāo)本都無(wú)交叉反應(yīng)，可用于登革病毒特異性的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。（3）操作簡(jiǎn)單，結(jié)果

18、觀察直觀明了，采用閉管檢測(cè)和熒光技術(shù)，避免了普通PCR方法容易產(chǎn)生交叉污染而發(fā)生非特異性擴(kuò)增的缺陷，并可防止病毒擴(kuò)散及環(huán)境污染，以及強(qiáng)致癌物溴乙錠對(duì)操作人員的危害。（4）快速。傳統(tǒng)的登革病毒分離方法耗時(shí)較長(zhǎng)，至少需半個(gè)月，而本方法所需時(shí)間僅4h，比傳統(tǒng)方法大為縮短，適用于登革病毒的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 肖維威，馬文麗，鄭文嶺.登革病毒的基因組結(jié)構(gòu)及其基因檢測(cè).中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(3)：188-189.2 Jelinek T. Dengue fever in international travelers. Clin Infec Dis，2000，31：144-147.3 Schwartz E， Mileguir F， Grossman Z，et al. Evaluation of ELISA-based sero-diagnosis of dengue fever in travelers. J Clin Virol，2000，19(3)：169-173.4 Drosten C， Gottig S， Schilling S， et al. Rapid detection and qu