第六章PCR引物設(shè)計ppt課件

1、第六章第六章 PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用使用主要內(nèi)容 引物設(shè)計原理 引物設(shè)計的優(yōu)化原則 Primer Premier 5.0 引見 舉例說明引物的設(shè)計引物設(shè)計原理 引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物設(shè)計總體上包含三個程序：序列下載，同源性比較，引物設(shè)計篩選 。引物設(shè)計的原則1、引物長度 大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個核苷酸。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618)的引物；若產(chǎn)物長5 kb，則用24個核苷酸的引 物。有人用2023個核苷酸引物得到40 kb的產(chǎn)物。 引物設(shè)計的原則2、引物GC含量 GC含量

2、在40%60%之間，以45-55為宜。這可為有效退火提供足夠熱。 引物設(shè)計的原則3、引物Tm 引物所對應(yīng)模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之間。 Tm=2(A+T)+4(C+G) （引物長度在25 bp以下） 對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size 公式中，Size = 引物長度。 引物設(shè)計的原則4、引物3端引物3末端和模板的堿基完全配對 防止一對引物內(nèi)的同源性 考慮末端5個堿基的G，最好不要富含G/C 引物3端要避開密碼子的第3位 引物設(shè)計的原則引物設(shè)計的原則5、選擇、選擇T引物引

3、物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的錯配的引發(fā)效率介于引發(fā)效率介于A、T之間，所以之間，所以3端最好選擇端最好選擇T，避免避免A。 引物設(shè)計的原則6、最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比如DNAman比對Alignment），各

4、基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 引物設(shè)計的原則7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序 列 引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Hairpin使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 引物設(shè)計的原則8、堿基要隨機分布 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C ），否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)False priming）。引物設(shè)計的原則9、引物應(yīng)具有特異性 引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 引物設(shè)計的原則10、G值 G值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程

5、度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9G值為負(fù)值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。 引物設(shè)計的原則11、引物的5端 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾，引物5 端修飾包括：加酶切位點、標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物設(shè)計的原則12、在DNA測序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物 Primer Premier 5.0 簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DN

6、A 基元(motif)查找4、同源性分析Primer Premier 5.0使用介紹Preimer Premier 啟動界面Load sequence基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設(shè)計界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense

7、strandUseful information of the primer引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度NoImage搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But 引物編輯引物編輯Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Retu

8、rn to the main window義務(wù)義務(wù)用綠色熒光蛋白用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記標(biāo)記蛋白蛋白NR1舉例說明舉例說明SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgaca

9、t tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagcca

10、cccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gctt

11、ggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的編碼序列的編碼序列(4000bp)紅色為信號肽紅色為信號肽, 藍(lán)色為藍(lán)色為BamHI酶切位點酶切位點, 下劃線標(biāo)出酶切位點的閱讀框下劃線標(biāo)出酶切位點的閱讀框 ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCT

12、GACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGA

13、C GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC

14、TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)引物要求 PCR擴增GFP GFP兩邊添加BamHI酶切位點 保證NR1的閱讀框不改變5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTC

15、ATT 5Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：擴增第一步：擴增GFP基本序列基本序列變性變性, 引物復(fù)性引物復(fù)性第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGG

16、A.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）第三步：酶切位點Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）BamHI: ggatccPrimer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatc

17、cCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Prim

18、er1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAatgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaa