纖維蛋白支架對人嗅鞘細(xì)胞髓鞘形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1、纖維蛋白支架對人嗅鞘細(xì)胞髓鞘形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響         11-03-24 11:11:00     編輯：studa20             作者：陳靜 黃秋生, 竇毅 宗海洋，崔顏宏 莊琴 孫湘蘭 龔愛華，張志堅【摘要】  目的： 探討纖維蛋白支架對人嗅鞘細(xì)胞髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法： 將體外培養(yǎng)的成人鼻粘膜嗅鞘細(xì)胞種植于纖維

2、蛋白支架，用多聚賴氨酸修飾的玻片作為對照底物，培養(yǎng)14 天后用掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并對細(xì)胞內(nèi)髓鞘形成相關(guān)蛋白2,3環(huán)核苷3磷酸二酯酶（2,3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase，CNPase）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein， MBP）進(jìn)行免疫熒光染色定位和免疫印跡半定量測定，分析纖維蛋白支架對人嗅鞘細(xì)胞CNPase和MBP表達(dá)的影響。結(jié)果： 人嗅鞘細(xì)胞種植于纖維蛋白支架后，其形態(tài)為長條帶狀，細(xì)胞成束排列，方向一致。細(xì)胞內(nèi)CNPase和MBP表達(dá)水平明顯高于對照組。結(jié)論： 纖維蛋白支架與人嗅鞘細(xì)胞具有很好的生物相容性并可促

3、進(jìn)細(xì)胞表達(dá)髓鞘相關(guān)蛋白CNPase和MBP；將該組織工程支架用于移植治療脊髓損傷，有利于再生神經(jīng)纖維的髓鞘形成。 【關(guān)鍵詞】  人嗅鞘細(xì)胞； 組織工程支架； 纖維蛋白（原）； 2,3環(huán)核苷3磷酸二酯酶； 髓鞘堿性蛋白    Abstract  Objective: To investigate the effects of fibrin scaffold on the myelin associated proteins expression of the human olfactory ensheathing cells(hOECs) der

4、ived from olfactory mucosa. Methods： The hOECs were cultured and seeded separately onto the fibrin scaffolds as experimental group and the glass slides modified with polyLlysine（PLL）as control group. After cultured 14 days, the morph of the hOECs was observed by scanning electron microscopy. To inve

5、stigate the effects of fibrin scaffold on the myelin associated proteins expression, the hOECs were immunofluorescence stained with antibodies against 2,3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase(CNPase) and myelin basic protein(MBP). The relative contents of CNPase and MBP were detected by Western blo

6、tting.  Results： The hOECs growthed on the fibrin scaffold showed ribbonlike and arranged in alignment. Some hOECs had migrated into the scaffolds. The results of immunofluorescence staining and Western blotting indicated that the expressions of CNPase and MBP of hOECs grew on the fibrin scaffo

7、ld were higher than that in the control group.  Conclusion： The fibrin scaffold possesses a good biocompatibility with hOECs and could promote expressions of CNPase and MBP in the hOECs seeded in the scaffold. The tissue engineering composed of hOECs and fibrin could be used for implantation to

8、 repair the injured spinal cord.    Key words  human olfactory ensheathing cells(hOECs); tissue engineering scaffold; fibrin/fibrinogen; 2,3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase(CNPase); myelin basic protein(MBP)    現(xiàn)有研究資料表明，嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移

9、植修復(fù)脊髓損傷可促進(jìn)實驗動物的神經(jīng)再生和改善后肢運(yùn)動功能1,2。臨床試驗結(jié)果亦顯示OECs移植治療脊髓損傷具有良好的應(yīng)用前景3-6。成人鼻黏膜OECs因取材方便，可用于自體移植，對其生物學(xué)特性及與支架材料的生物相容性進(jìn)行研究具有更重要的實用價值7。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠鼻腔嗅黏膜OECs在纖維蛋白支架上生長良好8。但是，成人嗅黏膜OECs與纖維蛋白的生物相容性如何，尤其是纖維蛋白支架對人嗅鞘細(xì)胞（human olfactory ensheathing cells, hOECs）髓鞘形成相關(guān)蛋白的表達(dá)有何影響，仍不清楚。本研究將體外培養(yǎng)的成人嗅黏膜OECs種植于纖維蛋白(fibrin, F

10、b)支架，用多聚賴氨酸修飾的玻片作為對照底物，觀察纖維蛋白支架對hOECs的形態(tài)及其2,3環(huán)核苷3磷酸二酯酶（2,3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase，CNPase）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）表達(dá)水平的影響，以探討hOECs/纖維蛋白支架移植入脊髓損傷部位對再生神經(jīng)纖維髓鞘形成的影響，為進(jìn)一步評價hOECs/纖維蛋白支架移植修復(fù)脊髓損傷的可行性提供實驗研究資料。    1  材料和方法    1.1  嗅黏膜的活體取材和細(xì)胞培養(yǎng)

11、60;   嗅黏膜取自健康男性自愿者，42歲。消毒面部皮膚和鼻腔，鼻黏膜局部麻醉，在無菌條件下用鼻竇內(nèi)窺鏡自一側(cè)上鼻甲鉗夾0.5 cm×0.5 cm嗅黏膜。嗅黏膜取出后用DMEM/F12（v/v=11，pH=7.3）培養(yǎng)基(Gibco公司)漂洗3次去除血跡后移至0.25%胰酶中，用眼科剪充分剪碎并用吸管吹打，制成嗅黏膜混合細(xì)胞懸液，用含10胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，離心清洗去除胰酶。用含10胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml接種于無包被的玻璃培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37，5% CO2）培養(yǎng)。每3天換液一次，每天觀察細(xì)胞的生長情況，數(shù)碼相機(jī)照相

12、。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時進(jìn)行消化、傳代。將第4代細(xì)胞接種于鋪有圓蓋片的24孔培養(yǎng)板，體外培養(yǎng)48 h后用于免疫熒光染色。    1.2  體外培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定    接種于鋪有圓蓋片的24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞在棄去培養(yǎng)液后用PBS漂洗，4%低聚甲醛固定24 h。用嗅鞘細(xì)胞標(biāo)志蛋白的抗體對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光（Cy3）染色。操作步驟如下：細(xì)胞經(jīng)0.25% TritonX100 37孵育1 h；3BSA 37封閉1 h；兔抗NGFRp75（Santa Cruz公司）、小鼠抗S100（Sigma公司）和GFAP（Antibo

13、dy Diagnostica公司）抗體4孵育過夜，37孵育2 h；PBS 漂洗后用抗兔或抗鼠IgGCy3(Sigma公司) 37孵育1 h; 用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核顯示全部細(xì)胞，以便分析嗅鞘細(xì)胞在培養(yǎng)細(xì)胞中所占的比例。PBS 漂洗后中性甘油封片，于Leica熒光顯微鏡下觀察。    1.3  纖維蛋白支架及對照底物的制備    實驗分為支架組和對照組。支架及對照底物制備步驟如下：纖維蛋白支架：將纖維蛋白原（fibrinogen, Fg）溶解于無血清DMEM/F12（v/v=11，pH=7.2）混合培養(yǎng)基中，加入

14、等體積新鮮鼠血漿，F(xiàn)g的終濃度為50 mg/ml。對照底物：將多聚賴氨酸（polyLlysine, PLL）溶解于無血清DMEM/F12（v/v=11，pH=7.3）混合培養(yǎng)基，其終濃度為0.2 mg/ml。按上述方法分別制備Fg和PLL溶液，均勻涂抹于6孔培養(yǎng)板中和預(yù)先放有無菌圓玻片的24孔培養(yǎng)板中。將上述培養(yǎng)板置37培養(yǎng)箱，F(xiàn)g溶膠自然凝固為凝膠狀纖維蛋白支架，PLL溶液干燥后即為對照底物。    1.4  Fb支架及PLL底物上hOECs的培養(yǎng)及形態(tài)觀察    1.5  CNPase和MBP免疫熒光染色和免疫印跡測定