中藥藥理作業(yè)

1、中藥青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評價李曉 張恩戶摘要：目的 對青蒿素抗腫瘤藥理作用及機(jī)制進(jìn)行文獻(xiàn)再評價。方法 查閱、歸納、整理2012年以前公開發(fā)表的有關(guān)青蒿素抗腫瘤的研究文獻(xiàn)，根據(jù)藥物藥理作用的評價原則和評定標(biāo)準(zhǔn)，對青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評價，以明確其治療腫瘤作用。結(jié)果：青蒿素體外抗腫瘤藥理作用確切，體內(nèi)抗腫瘤作用不確切，且作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。 關(guān)鍵詞 青蒿素 腫瘤 文獻(xiàn)再評價新世紀(jì)全國高等中醫(yī)院校規(guī)劃中藥藥理學(xué)專論（人民衛(wèi)生出版社，2009年）收載的中藥青蒿素有抗瘧原蟲、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌等作用。為此，我們以該教材中青蒿素抗腫瘤作用為研究對象，通過文獻(xiàn)查閱、歸納

2、、整理，并根據(jù)青蒿素抗腫瘤作用的評價原則，進(jìn)行文獻(xiàn)再評價，以明確其抗腫瘤的藥理作用及作用機(jī)制1. 腫瘤與抗腫瘤藥理作用的評價1.1腫瘤的涵義： 腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在不同致癌因素長期作用下，在基因水平上失去了對其生長的正常調(diào)控而致的克隆性異常，所形成的新生物。腫瘤在本質(zhì)上表現(xiàn)為細(xì)胞失去控制的異常生長，這種異常生長的能力除了表現(xiàn)腫瘤本身持續(xù)生長外，在惡性腫瘤還表現(xiàn)為對鄰近正常組織的侵犯及經(jīng)血管、淋巴管和體腔轉(zhuǎn)移到身體其他部位，這往往是不能徹底治愈和致死亡的主要原因。目前已基本明確腫瘤的發(fā)病機(jī)制有：（1）腫瘤細(xì)胞的基本特征是細(xì)胞生長失控和分化受阻其去分化的一個重要特征就是 G1-S期卡點失常進(jìn)入S期的細(xì)

3、胞異常增多（2）腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴血管生成 許多與血管關(guān)系密切的腫瘤可以自分泌血管內(nèi)皮生長因子受體，提高血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移最終導(dǎo)致腫瘤血管生長 （3）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是多種腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤可以誘導(dǎo)淋巴管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過新生的淋巴管向區(qū)域（4）與正常細(xì)胞相比，大部分癌細(xì)胞鐵吸收率較高 ，因為癌細(xì)胞分裂時需要大量鐵質(zhì)才能復(fù)制染色體，且癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量顯著高于正常細(xì)胞 1.2抗腫瘤的評價方法：腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在基因水平上失去了對其生長的正常調(diào)控而致的克隆性異常，所形成的新生物，主要病因是機(jī)體內(nèi)外不同致癌因素，對于抗腫瘤的實驗研究主要是建立動物移植性腫瘤模型及體外瘤

4、細(xì)胞培養(yǎng)，利用以下實驗方法觀察瘤細(xì)胞生長過程中形態(tài)學(xué)及的動態(tài)變化。1動物移植性腫瘤模型 觀察計算，流細(xì)胞儀測定，酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測定2. MTT法3. DNA電泳及NBT還原試驗方法4. 集落形成法 5. 選用臨床使用的放療源如60Co或X光，與中藥合用，及選用烷化劑、代謝拮抗劑或抗腫瘤抗菌素等有代表性的抗腫瘤藥，與中藥合用6. 人體腫瘤裸鼠異種移植模型采用相對腫瘤體積的腫瘤增殖速率(T/C%)等方法7. 其他：影響荷瘤動物免疫功能及腫瘤抑制試驗2.再評價方法2.1文獻(xiàn)收集：查閱有關(guān)實驗性研究文獻(xiàn)，其中，1979年以前的查閱中藥研究文獻(xiàn)摘要（劉壽山主編，科學(xué)出

5、版社 18201984），19792012年間的文獻(xiàn)以中國知網(wǎng)http:/ 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫為主，其他數(shù)據(jù)庫為輔進(jìn)行檢索，查閱。2.2文獻(xiàn)整理：制作中藥青蒿素抗腫瘤的藥理作用文獻(xiàn)再評價信息表,內(nèi)容包括供試藥或儀器準(zhǔn)備，給藥方法或試驗用藥法，細(xì)胞株和（或）實驗動物，實驗方法，陽性結(jié)果，實驗結(jié)果與結(jié)論，作者及工作單位，刊物發(fā)表年代。研讀文獻(xiàn)，摘錄相關(guān)信息并填入表格，進(jìn)行分析，結(jié)果見表。青蒿素抗腫瘤的藥理作用研究文獻(xiàn)一覽表實驗方法衡量指標(biāo) 衡量指標(biāo)文獻(xiàn)篇數(shù)建立動物移植性腫瘤模型觀察計算腹水型EAC小鼠生命小鼠生命延長率1移植瘤抑瘤率2流式細(xì)胞儀測定移植瘤抑瘤率瘤細(xì)胞凋亡率1酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測

6、定Caspase-3活性Caspase-3活性2體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)臺盼藍(lán)染色試驗增殖抑制作用細(xì)胞活力2透射電鏡或熒光鏡觀察凋亡小體4流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率4端粒酶活性1MTT比色法瘤細(xì)胞的毒性1瘤細(xì)胞抑瘤率9IC503細(xì)胞數(shù)細(xì)胞計數(shù)法生長抑制曲線2流式細(xì)胞技術(shù)MCF-7/ ADR細(xì)胞P-糖蛋白1熒光分光光度計檢測細(xì)胞線粒體膜電位細(xì)胞線粒體跨膜電位1Wesen-botting 檢測線粒體細(xì)胞漿細(xì)胞色素 C的表達(dá)細(xì)胞色素 C蛋白條帶1單細(xì)胞凝膠電泳( SCGE)細(xì)胞核DNA的損傷細(xì)胞核DNA1誘導(dǎo)分化細(xì)胞分化1transwell小室法和沖刷實驗細(xì)胞的侵襲、黏附和趨化運動能力12.3青蒿素抗腫瘤的評定

7、方法：評價青蒿素抗腫瘤的藥理作用主要是通過動物移植性腫瘤模型觀察計算移植瘤抑瘤率、瘤細(xì)胞凋亡率；體外瘤細(xì)胞采用臺盼藍(lán)染色試驗測細(xì)胞活力及MTT比色法檢測瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和端粒酶活性，因此可將瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50、細(xì)胞凋亡率、移植瘤抑瘤率相關(guān)性分析作為重要的量化指標(biāo)。實驗研究，且實驗方法較多；線粒體參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展及調(diào)控過程，細(xì)胞線粒體跨膜電位下降及端粒酶活性降低，細(xì)胞的生長抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞線粒體跨膜電位、端粒酶活性也可作為一個指標(biāo)。此外，通過抑制谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶的活性可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥的多藥抗性，聯(lián)合轉(zhuǎn)鐵蛋白可以逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的多藥耐

8、藥性，與吡柔比星多柔比星等抗腫瘤藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用；輻射增敏作用檢測也是一種重要的方法。對腫瘤組織進(jìn)行分子學(xué)研究，觀察DNA也是一個指標(biāo)。由于青蒿素藥理作用復(fù)雜，藥理作用間也會相互影響，一兩種方法可能出現(xiàn)偏差，所以中藥藥理作用的評價應(yīng)符合綜合評價和重復(fù)性等原則。根據(jù)上述原則，確定評定標(biāo)準(zhǔn)為：采用3種以上上述實驗方法，且每種實驗方法不少于2次重復(fù)實驗，結(jié)果均有效。對于每一種實體型動物移植性腫瘤模型，推薦采用瘤重的腫瘤抑制率（%）作為試驗評價指標(biāo)。評價標(biāo)準(zhǔn)通常為抑制率（%）50 %，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P < 0.05為有效。針對每一種人體腫瘤異體移植瘤模型，推薦采用相對腫瘤增殖率T/C（%）

9、作為試驗評價指標(biāo)。評價標(biāo)準(zhǔn)通常為：T/C（%）>50 %為無效；T/C（%） 50%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P < 0.05為有效。在體內(nèi)有效性試驗采用的全部人體腫瘤異體移植瘤模型中，一般至少應(yīng)有2種達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)，才提示藥物有必要進(jìn)入臨床試驗。在評價時還尤其應(yīng)關(guān)注受試物與陽性對照藥試驗結(jié)果的比較。在毒性相當(dāng)（在有效性研究中主要表現(xiàn)為動物死亡率和體重下降相當(dāng)）的情況下，對受試物治療組和陽性對照藥組腫瘤增殖率的比較也是評價受試物是否有必要進(jìn)入臨床試驗的重要指標(biāo)之一。體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，MTT法測定藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制作用，計算受試藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計算半數(shù)殺傷或抑制濃度IC

10、50。3.結(jié)果 根據(jù)青蒿素抗腫瘤藥理作用研究文獻(xiàn)一覽表表明：建立動物移植性腫瘤模型后，觀察計算移植瘤抑瘤率2篇、小鼠生命延長率1篇，流式細(xì)胞儀測定瘤細(xì)胞凋亡率1篇，酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測定Caspase-3活性2篇；體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，臺盼藍(lán)染色試驗，細(xì)胞活力2篇，MTT法測定中，瘤細(xì)胞抑制率9篇，瘤細(xì)胞的毒性1篇，IC50 3篇。透射電鏡或熒光鏡觀察，凋亡小體4篇，流式細(xì)胞儀測定中，細(xì)胞凋亡率4篇，端粒酶活性1篇，細(xì)胞數(shù)細(xì)胞計數(shù)法，生長抑制曲線2篇，流式細(xì)胞技術(shù)，MCF-7/ ADR細(xì)胞P-糖蛋白、熒光分光光度計檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位、Wesen-botting 檢測，細(xì)胞色素 C蛋白

11、條帶、單細(xì)胞凝電泳( SCGE)，細(xì)胞核DNA、誘導(dǎo)分化，細(xì)胞分化及transwell小室法和沖刷實驗，細(xì)胞的襲、黏附和趨化運動能力各1篇。其中2篇建立動物移植性腫瘤模型，包括肉瘤S180、癌細(xì)胞株小鼠移植性腫瘤模型和人胃癌細(xì)胞株SGC-790裸鼠移植瘤模型， 14篇采用體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，說明青蒿素具有一定體外抗腫瘤藥理作用，但體內(nèi)抗腫瘤藥理作用不確切。4.討論很多原因引起的惡性腫瘤，理化因素及基因因素明顯，從已有文獻(xiàn)來看，體外瘤細(xì)胞采用臺盼藍(lán)染色試驗測細(xì)胞活力及MTT比色法檢測瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率比較集中，大多數(shù)實驗方法主要基于體外瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)實驗的研究，通過動物

12、移植性腫瘤模型研究藥物的抗腫瘤機(jī)制，但缺乏實驗的重復(fù)性。因此有必要規(guī)范青蒿素抗腫瘤的藥理作用評價方法，如實驗方法、重復(fù)次數(shù)等。確定青蒿素抗腫瘤藥理作用的評定標(biāo)準(zhǔn)為：a.動物移植性腫瘤模型：應(yīng)采用觀察、計算法計算小鼠生命延長率，進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，計算移植瘤抑瘤率，需進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定瘤細(xì)胞凋亡率，需進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗；應(yīng)用酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測定，進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，每種采用3種以上上述實驗方法，且每種實驗方法不少于2次重復(fù)實驗，結(jié)果顯示實驗方法的重復(fù)次數(shù)不夠，實驗結(jié)果表明小鼠生命延長率明確，但無統(tǒng)計學(xué)意義。體外瘤細(xì)胞：采用臺盼藍(lán)染色試驗測細(xì)胞活力

13、進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，MTT比色法檢測瘤細(xì)胞抑瘤率進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗及IC50進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率進(jìn)行不少于2次重復(fù)實驗，每種采用3種以上上述實驗方法，且每種實驗方法不少于2次重復(fù)實驗，結(jié)果均有效。按照此標(biāo)準(zhǔn)對中藥藥理學(xué)教材收載的青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評價結(jié)果表明，青蒿素有體外抗腫瘤藥理作用，但體內(nèi)抗腫瘤藥理作用及藥理機(jī)制不明確。腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在不同致癌因素長期作用下，在基因水平上失去了對其生長的正常調(diào)控而致的克隆性異常所形成。近年來,關(guān)于青蒿素抗腫瘤的作用機(jī)制研究十分活躍,綜述如下：1抑制細(xì)胞增殖 腫瘤組織生長迅速，細(xì)胞分裂增生旺盛，抑制腫瘤細(xì)胞的分

14、裂增生，將其阻斷在某個或者某幾個細(xì)胞周期，是多數(shù)抗腫瘤藥物的作用靶點，實驗證實青蒿有效成分可作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖另外；2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的一項重要機(jī)理，細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格基因控制的細(xì)胞自主死亡過程的，研究表明參與細(xì)胞凋亡的途徑主要有3種：線粒體通路基因調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，細(xì)胞凋亡作用線粒體途徑：線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，它不僅為細(xì)胞生活提供充足的能力，而且可作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的感受器和放大器，對細(xì)胞存活起重要調(diào)控作用;凋亡基因調(diào)控途徑： 家族蛋白線粒體，其成員與蛋白的比值決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡 基因是惡性腫瘤最為重要的拮抗亡基因，而在 則情況相反， 高表達(dá)時，則凋

15、亡指數(shù)高， 低表達(dá)或不表達(dá)時凋亡指數(shù)低;3.通過鐵離子介導(dǎo)而形成內(nèi)過氧化橋 ，并產(chǎn)生活性氧離子（ROS ）和以碳為核心的自由基，后者使細(xì)胞發(fā)生分子損傷和細(xì)胞死亡，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子的結(jié)合，使其過氧橋斷裂，進(jìn)而釋放大量自由基破壞癌細(xì)胞細(xì)胞膜，癌細(xì)胞則因大量胞漿外流而死亡 ；4.抗血管生成，抗腫瘤治療的一個重要靶點是抗腫瘤新生血管生成血管生成的中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生遷移分裂和分化，隨后形成管腔結(jié)構(gòu)腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，共同調(diào)控的結(jié)果，還有其他一些與抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)的作用，例如調(diào)節(jié)免疫 增加放化療敏感性等作用;5.逆轉(zhuǎn)多藥耐藥 多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物耐藥的

16、同時，對其他許多結(jié)構(gòu)各異的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象多藥耐藥是臨床上腫瘤化療失敗的主要原因青蒿素與傳統(tǒng)腫瘤化療藥物的作用機(jī)制不同，與其不存在交叉耐藥，并且可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，這些資料為青篙素類藥物有可能成為具有臨床應(yīng)用價值的抗癌新藥，但對其作用機(jī)制和抗腫瘤活性作用仍需進(jìn)行深人的研究。 主要參考文獻(xiàn)1 余和平、崔 樂等 青蒿素對乳腺癌多藥耐藥MCF_7_ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用第40卷第1期第91頁2011年2月 華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2 曾靜、曹建平 青蒿素對人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用 蘇州大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版2009年29卷2期3 宮曉梅、周道安 青蒿素對人宮頸癌細(xì)胞的毒性和放射增敏

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