淺談SiRNA逆轉(zhuǎn)肺耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥

1、淺談SiRNA逆轉(zhuǎn)肺耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥         【摘要】  目的：研究雙鏈短干擾RNA（siRNA）對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞模型（K562/NaB）肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）表達(dá)及功能的影響. 方法： 針對(duì)LRP基因設(shè)計(jì)合成特異性siRNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染K562/NaB；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)K562細(xì)胞LRP mRNA的水平；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562/NaB細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的變化和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素（DNR）的蓄積；MTT法檢測(cè)阿霉素（ADM）對(duì)K56

2、2/NaB細(xì)胞耐藥的半數(shù)抑制濃度（IC50）. 結(jié)果： siRNA轉(zhuǎn)染后：K562/NaB細(xì)胞的LRP mRMA水平明顯降低；LRP蛋白表達(dá)由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性；細(xì)胞內(nèi)DNR的蓄積明顯增加，DNR平均熒光增強(qiáng)3.28倍；對(duì)ADM藥物敏感相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為78.18%. 結(jié)論： siRNA可逆轉(zhuǎn)由LRP介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥.  【關(guān)鍵詞】  RNA，小分子干擾；基因，肺耐藥相關(guān)蛋白；K562細(xì)胞；抗藥性，多藥 【Abstract】 AIM:  To investigate the effect of short interfering RNA (siRNA) on exp

3、ression and function of lung resistancerelated protein (LRP) in the multidrug resistant human leukemia cells (K562/NaB). METHODS:  Multidrugresistant K562 cells with high level LRP expression treated with sodium butyrate (NaB), was used as an in vitro model system. LRP specific siRNA was synthe

4、sized and transfected into the K562/NaB cells. Expression of LRP mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR), and protein level and intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/NaB cells were detected by flow cytometry. 50% inhibition concentration (IC50) of

5、adriamycin (ADM) on K562/NaB cells was detected by MTT method. RESULTS: LRP mRNA level was decreased obviously; the protein expression was turned from positive result to negative result. Intracellular DNR accumulation was increased and the mean fluorescence of DNR was 3.28 times higher. The relative

6、 efficiency to ADM was 78.18. CONCLUSION: The siRNA could effectively reverse the multidrug resistance of leukemia cells induced by LRP. 【Keywords】RNA, small interfering; gene, lung resistancerelated protein;  K562 cells; drug resistance, multiple 0引言 肺耐藥相關(guān)蛋白（lungrelated resistant protein， 

7、; LRP）是一種新型的與多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）相關(guān)的糖蛋白，主要導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物聚集缺陷，而在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)引起MDR. 在兒童白血病以及成人髓系白血?。ˋML）中，LRP表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后決定因素之一，其過(guò)度表達(dá)造成患者對(duì)化療不敏感，提示預(yù)后不良1-2.  雙鏈短干擾RNA（short interfering RNA， siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNA interference， RNAi），是在特異性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因方面的最新突破3-4.  我們?cè)诮⒘私?jīng)丁酸鈉（sodium butyrate， NaB）誘導(dǎo)人AML系 K5

8、62細(xì)胞，高表達(dá)LRP并介導(dǎo)多藥耐藥的細(xì)胞模型（K562/NaB）的基礎(chǔ)上5，設(shè)計(jì)合成了LRP特異性siRNALRP，并轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞模型，觀察siRNALRP抑制LRP基因和蛋白表達(dá)、消除LRP改變細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積和分布作用的效果，以期為逆轉(zhuǎn)LRP介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞MDR、提高兒童難治性和復(fù)發(fā)性白血病化療效果探索新的方法，并探討以siRNA介導(dǎo)的RNAi用于腫瘤細(xì)胞MDR治療的可行性. 1材料和方法 1.1材料 AML細(xì)胞系K562細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；單克隆抗體LRP56為Monosan公司產(chǎn)品；固定和破膜試劑盒、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體

9、為Caltolog Laboratories產(chǎn)品；NaB為Sigma公司產(chǎn)品. LRP特異性短干涉RNA(siRNALRP)自行設(shè)計(jì)，由Dharmacon公司合成. 濃度20 mmol/L，序列：5 GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT   （正義鏈），dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5   （反義鏈）. 1.2方法 1.2.1K562細(xì)胞培養(yǎng)和高表達(dá) LRP的K562多藥耐藥細(xì)胞模型（K562/N）10K562細(xì)胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37, 50 ml/L CO2

10、條件下培養(yǎng). K562細(xì)胞在含2 mmol/L NaB的培養(yǎng)液中處理3 d，制作K562細(xì)胞高表達(dá)LRP的多藥耐藥細(xì)胞模型，命名為K562/NaB. 陰性對(duì)照組不加NaB. 1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)K562/NaBsiRNA組：取K562/NaB細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每孔500 L，濃度為3×108/ L. 分別以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液 50 L稀釋siRNALRP,  Lipofectamine各1 L，混勻靜置后加入細(xì)胞懸液. 再加入NaB使終濃度為2 mmol/L，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng). 每24 h以含2 mmol/L NaB的RPMI 1640培養(yǎng)基500 L

11、換液，連續(xù)3 d. 轉(zhuǎn)染后24, 48, 72 h分別取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè). K562/NaBH2O組：取K562/NaB細(xì)胞，以無(wú)RNase水代替siRNALRP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法、實(shí)驗(yàn)條件同siRNA轉(zhuǎn)染組. 取轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè). 對(duì)照組： K562/NaB細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；原始的K562細(xì)胞作為陰性對(duì)照. 1.2.3RTPCR方法檢測(cè) K562細(xì)胞LRP mRNA水平同時(shí)取實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組細(xì)胞各1×106，以Trizol提取總RNA，以RTPCR檢測(cè)LRP mRNA水平. 反轉(zhuǎn)錄以O(shè)ligo(dt)15作為引物，37 1 h. PCR引物：LRP上游引物：5GAT CCG A

12、CC AGT CAG AAG CCG AG3，下游引物：5AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3，擴(kuò)增產(chǎn)物300 bp. 內(nèi)對(duì)照GAPDH上游引物：5AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3，下游引物：5CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3，擴(kuò)增產(chǎn)物590 bp. 擴(kuò)增條件：95 1 min，然后按94  40 s, 58 45 s, 70  45 s，循環(huán) 30次，最后以72 10 min結(jié)束反應(yīng). RTPCR產(chǎn)物電泳，LRP條帶和GAPDH條帶吸收峰比值LRP/GAPDH0.3，視為L(zhǎng)RP mRNA表

13、達(dá)陽(yáng)性. 1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) K562細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)以LRP的單克隆抗體LRP56為一抗，PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，標(biāo)記各組K562細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)其LRP蛋白的表達(dá)情況. 同時(shí)取實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組的細(xì)胞各1×106，依次加入前固定液、打孔劑和LRP56單抗混合物、PE標(biāo)記羊抗鼠IgG，避光保存. 各步驟間以含1 ml/L 疊氮鈉、100 ml/L 小牛血清的PBS 洗滌細(xì)胞2次. 標(biāo)記4 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)LRP蛋白表達(dá)，LRP陽(yáng)性細(xì)胞5%視為陽(yáng)性結(jié)果. 1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素（daunorubicin, DNR）蓄積同時(shí)取K562/NaBsiR

14、NA組轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞、K562/NaBH2O組和陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照細(xì)胞各2×106，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，加入DNR使終濃度為1  mol/L，于37, 50 mL/L CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)2 h. 洗滌后立即以流式細(xì)胞儀FL 2通道在相同條件下隨機(jī)檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞. 以不加DNR的K562細(xì)胞作為空白對(duì)照. 1.2.6MTT法檢測(cè) ADM的IC50同時(shí)取K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞、K562/NaBH2O組和陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/

15、L，在96孔板的各孔中加入180 L細(xì)胞和不同濃度（0.1 g 100.0 g）的ADM，培養(yǎng)72  h后每孔加入20 L  5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值. 按以下公式分別計(jì)算相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率. 相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率=（IC50A- IC50B）/（IC50A-IC50C）. 其中IC50A是K562/NaB細(xì)胞的IC50，IC50B是轉(zhuǎn)染siRNA的K562/NaB細(xì)胞的IC50，IC50C是K562細(xì)胞的IC50.   統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用2檢驗(yàn)和OneWay ANOVA檢驗(yàn). P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 1K562/N

16、aB細(xì)胞LRP mRNA水平的變化 K562/NaBH2O組、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照LRP mRNA表達(dá)陽(yáng)性，其中陰性對(duì)照LRP/GAPDH 0.53，H2O轉(zhuǎn)染組、陽(yáng)性對(duì)照LRP/GAPDH分別為0.96, 0.98，較陰性對(duì)照明顯升高. K562/NaBsiRNA組中，轉(zhuǎn)染24, 48, 72 h, LRP mRNA檢測(cè)均為陰性，較K562/NaBH2O組、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照明顯減低（圖1）. 2K562/NaB細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的變化 K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染48 h和72 h的細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞LRP表達(dá)陰性；K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞、H2O轉(zhuǎn)染組、陽(yáng)性對(duì)照L

17、RP表達(dá)陽(yáng)性. 當(dāng)陰性對(duì)照LRP陽(yáng)性率為1.77%時(shí)，K562/NaBH2O組、陽(yáng)性對(duì)照LRP陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.11%和35.10%，后二者LRP表達(dá)無(wú)明顯差異（P0.05）；K562/NaBsiRNA組中，轉(zhuǎn)染24 h, 48 h, 72 h后，LRP陽(yáng)性率分別為14.98%, 1.39%和1.55%，轉(zhuǎn)染24 h后LRP表達(dá)較K562/NaB H2O組、陽(yáng)性對(duì)照明顯減少（P0.01）；轉(zhuǎn)染48, 72 h后， LRP陽(yáng)性表達(dá)較轉(zhuǎn)染24 h明顯減少（P0.01）.           2.3DNR在K562/

18、NaB細(xì)胞內(nèi)蓄積的變化 加入DNR的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的熒光，未加入DNR的空白對(duì)照K562細(xì)胞檢測(cè)到微弱熒光（平均熒光強(qiáng)度為4）. K562/NaBH2O組和陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度分別為38和36；陰性對(duì)照K562細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為115；K562/NaBsiRNA組轉(zhuǎn)染72 h的K562細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度為118，較K562/NaBH2O組細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了3.28倍(圖2). 4K562/NaB細(xì)胞藥物敏感性的變化 siRNALRP作用72 h后的K562/NaB細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性增加，藥物敏感相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為78.6%（表1）. 表明siRNALRP可以恢復(fù)

19、K562/NaB細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性. 表1siRNAs對(duì)ADM作用于K562/NaB細(xì)胞的IC50的影響（略）   3討論 在多種生物中，外源雙鏈RNA（double stranded RNA, dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞中，與其同源的mRNA受到降解，其相應(yīng)基因受到抑制，稱為RNA干涉（RNA interference, RNAi）6-8. 研究表明9-10，體外合成的小分子dsRNA能直接觸發(fā)RNAi，這些小分子dsRNA被稱為小干涉RNA（small interfering RNA），即siRNA. siRNA介導(dǎo)RNAi的機(jī)制主要由RNAi核酸酶催化，該酶包括一個(gè)dsRNA結(jié)合

20、區(qū)，一或多個(gè)RNA酶區(qū)域，以及一個(gè)RNA解旋酶區(qū)域. 首先dsRNA與RNA核酸酶結(jié)合，并被分解成為的2123nt的 siRNA，與該酶穩(wěn)定結(jié)合形成360 kDa的蛋白質(zhì)RNA復(fù)合體. siRNA特異地與同源mRNA結(jié)合，解旋酶區(qū)域催化mRNA與siRNA的正義鏈交換. 最終mRNA被降解，并再生成siRNA與RNAi核酸酶的復(fù)合體. 目前，RNAi技術(shù)以其高效性、特異性，在基因沉默中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的消除是其應(yīng)用的熱點(diǎn)之一. 我們?cè)O(shè)計(jì)合成了針對(duì)LRP的特異性siRNA，用以轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞高表達(dá)LRP的細(xì)胞模型，初步探討特異性siRNA降解LRP的mRNA、降低LRP蛋

21、白的表達(dá)的作用、消除LRP的藥泵功能的效果. 本研究的發(fā)現(xiàn)，以siRNALRP轉(zhuǎn)染NaB誘導(dǎo)3 d的K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h，LRP mRNA水平明顯下降，轉(zhuǎn)為陰性；LRP蛋白水平明顯下降；轉(zhuǎn)染48 h, 72 h, LRP LRP mRNA和LRP蛋白表達(dá)仍均為陰性. 在LRP改變細(xì)胞內(nèi)化療藥物蓄積和對(duì)化療藥物耐藥性方面，經(jīng)siRNALRP轉(zhuǎn)染72 h，K562/NaB細(xì)胞內(nèi)DNR蓄積增加，恢復(fù)到原始的K562細(xì)胞水平，對(duì)ADM的耐藥性明顯降低. 上述結(jié)果表明，siRNALRP能夠有效降解K562細(xì)胞LRP mRNA，使LRP蛋白表達(dá)受到抑制，并因此消除了LRP介導(dǎo)的MDR作用，因此有望成

22、為逆轉(zhuǎn)LRP介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MDR的有效方法. 【參考文獻(xiàn)】   1List AF, Spier CS, Grogan TM, et al. Overexpression of the major vault transporter protein lungresistance protein predicts treatment outcome in acute myeloid leukemiaJ. Blood, 1996, 87: 2464-2469. 2Volm M, Stammler G, Zintl F, et al. Expression of lung resistance

23、related protein (LRP) in initial and relapsed childhood acute lymphoblastic leukemiaJ. Anticancer Drugs, 1997, 8: 662-665. 3Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegansJ. Nature, 1998, 391: 806-811. 4Zamore PD. RNA interference: listening to the sound of silenceJ. Nat Struct Biol, 2001, 8: 746-750. 5李寧，錢新華，姚英民，等. 丁酸鈉誘導(dǎo)