高免卵黃抗體的制備及檢測(cè)

1、總第 96期 第 2期 2008年 06月高校實(shí)驗(yàn)室工作研究Seria l N o . 96, N o . 2 J un . 2008高免卵黃抗體的制備及檢測(cè)李忠英 1 馮剛利 2 羅躍中 1(1. 湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 2. 中國(guó)林業(yè)科技大學(xué) 湖南 株洲 412004摘 要 實(shí)驗(yàn)用 雞 IBD 以及幼兒風(fēng)疹病毒連續(xù) 免疫產(chǎn)卵母雞 3次 , 制備出 高免卵黃抗 體 , 并 對(duì)免疫球蛋 白的含量進(jìn)行檢測(cè) 。 結(jié)合瓊脂 雙擴(kuò)測(cè) 定免 疫球 蛋白 效價(jià) 為 :1:64-1:128, 風(fēng)疹 抗體 EL ISA 法測(cè) 定效 價(jià) :1: 10204-1:20480的結(jié)果 , 表 明本實(shí)驗(yàn)的免疫程序是可行的

2、 。 結(jié)合雞的 其他一些 生物學(xué)特點(diǎn) , 表明 利用免疫雞 制備抗體是一種簡(jiǎn)便 、 經(jīng)濟(jì) 、 高 效的抗體制備方法 。關(guān)鍵詞 風(fēng)疹病 毒 卵黃免疫球蛋白 酶聯(lián)免疫反應(yīng)0 前言目前 , 抗體在疾病的治療、 診斷及醫(yī)藥食 品的檢測(cè)中被廣泛的應(yīng)用 , 尋找一種快速、 簡(jiǎn) 潔的生產(chǎn)抗體的方法非常重要。卵黃免疫球 蛋白就是卵黃中的 r-卵黃球蛋白 1。其在 免疫學(xué)性質(zhì)方面與雞血清 I gG 一致 , 于卵黃 中特異性存在 , 由于其蛋白質(zhì)的物理、 化學(xué)性 質(zhì)、 免疫學(xué)性質(zhì)等方面與哺乳動(dòng)物 I gG 存在 一定的差異 , 所以在比較免疫學(xué)領(lǐng)域把由雞 卵黃中獲得的抗體稱作 Ig Y (I m m unog

3、lobu li n yo l k 24。用它可以彌補(bǔ)因?yàn)椴溉閯?dòng)物 I gG 及其結(jié)合物與類風(fēng)濕因子產(chǎn)生特異性結(jié)合對(duì) 實(shí)驗(yàn)造成的干擾。并能提高實(shí)驗(yàn)的特異性和 敏感性 , 是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重大發(fā)展 36。 在臨床上 I gY 已經(jīng)大量應(yīng)用于各種細(xì)菌和病 毒性疾病的預(yù)防和治療。1 材料與方法1. 1 主要試劑風(fēng)疹病毒 (市一醫(yī)院病毒所提供 、 雞傳 染性法氏囊活疫苗 (中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 南京藥械廠 、 雞法氏囊瓊擴(kuò)抗原 (中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 、 二抗 (兔抗雞 , 鼎 國(guó)生物產(chǎn)品發(fā)展中心 、 陽性血清 (中檢所 。 1. 2 高免雞蛋的制備免疫雞 的方 法 有許 多 種 , 本

4、實(shí) 驗(yàn)采 用 H assl 等 6第一次抗原加福氏佐劑從雞翅膀 下肌肉注射 , 之后分別在第 10天、 第 20天及 第 30天用純福氏佐劑從肌肉加強(qiáng)注射。一 般免疫一只雞可獲取高產(chǎn)高產(chǎn)的特異 Ig Y 長(zhǎng) 達(dá) 928周 5。1. 3 卵黃原液的處理 71. 3. 1 水 稀釋法 取卵黃原液 10m l 用蒸 餾水稀釋至 100m l(即稀釋 10倍 , 然后調(diào)節(jié) p H 到 5. 25. 3, 在 4 下靜置 6小時(shí) , 取出 稀釋液 , 用離心機(jī) 6000r/mi n , 離心 30分鐘 , 以得到待測(cè)液。1. 3. 2 氯 仿抽提法 卵黃原液加入滅菌的 燒杯中 , 用滅菌生理鹽水稀釋 1

5、倍 , 再加入與 卵黃原液生理鹽水等體積的氯仿 , 充分振蕩 后 , 37 水 浴 30分鐘 , 其 間攪 拌 23次 , 4000r /mi n , 離心 20分 鐘后 , 待 測(cè)樣 品分 三 層 , 一層為所需的提取液、 第二層是蛋黃 , 第 三層是氯仿。1. 4 抗體活性與含量檢測(cè)1. 4. 1 瓊脂 雙 擴(kuò) 測(cè) 活 性 取 一清潔 載玻 片 , 傾注 5m l 加熱溶化的 1. 5%食鹽瓊脂 , 制 備瓊脂板。待瓊脂板凝固后 , 用打孔器打孔。 孔間距為 5mm 。然后卵黃 原液用 0. 8%的*作者簡(jiǎn)介 :李忠英 (1980-, 女 , 湖南邵東人 , 助理實(shí)驗(yàn)師 , 主要從事實(shí)驗(yàn)教

6、學(xué)管理 工作。PBS 做倍比稀釋 , 分別是 :1:2、 1:4、 1:8、 1:16 用微量加樣器 在中間孔 中加入診 斷抗 體 , 在周圍孔中加入 I B DV 瓊擴(kuò)抗原 , 加入的 量以不溢出瓊脂面為宜。加樣后至于帶蓋飯 盒 (內(nèi) 鋪濕 紗布 , 置 37 溫 箱中 , 分別 于 24、 48、 72小時(shí)觀察結(jié)果4。1. 4. 2 瓊 脂 單 擴(kuò) 測(cè) 定 含 量具體 是先 將3%瓊脂置于沸水中加熱融化 , 吸取一定量放 入 56 水浴保溫。再加入一定濃度 的二抗 溶液 , 混勻。將含二抗的瓊脂到在玻板上制 成瓊脂板 , 凝固后按 1. 5c m 距離打孔。向孔 中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原。樣

7、品也做稀釋點(diǎn) 樣 , 把已加樣的瓊脂板置于濕盒內(nèi) 37 溫箱 培養(yǎng) , 24小時(shí)后觀察結(jié)果。然后依據(jù)待檢標(biāo) 本孔沉淀直徑對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其含量。1. 4. 3 酶聯(lián)免疫測(cè)定抗風(fēng)疹病毒抗體活性用5ug /ml 的風(fēng)疹抗原包被聚乙烯板 4 過夜 , 然 后用 PBS ! Tween20洗滌液洗滌 3次。加入 1. 5%BSA 溶液 37 保溫半小時(shí)。樣品用稀 釋液倍比稀釋后 加入酶標(biāo)板 37 保溫 2小 時(shí) , 接著加入二抗 (1:400 37 保溫 2小時(shí) , 最 后顯色。顯色結(jié)果直到其 OD 值低于 0. 2, 則 該稀釋度為抗體的活性 (見圖 4 。 1. 5 I g Y 提取過程中的樣品的

8、跟蹤檢測(cè) 對(duì)該流程中各個(gè)階段得到的液體進(jìn)行取 樣 , 然后采用單擴(kuò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其流程中各個(gè)階段 樣品 中 Ig Y 含 量進(jìn) 行了 跟蹤 檢測(cè) , 以求 的 I g Y 提取過程中 I gY 含量的變化值 , 為 Ig Y 的 提取提供一些參考數(shù)據(jù)。2 結(jié)果與討論2. 1 I B D 免疫結(jié)果 :見圖 1。 圖 1 雞勉疫后的 Igy 效價(jià)與時(shí)間的關(guān)系免疫母雞種齡均一 , 生長(zhǎng)發(fā)育情況較一 致 , 免疫后測(cè)不同雞蛋的效價(jià) , 不存在太大的 個(gè)體差異。該雞群未免疫及傳染病史 , 不影 響實(shí)驗(yàn)。自飲水激活免疫后 , 定時(shí)檢測(cè)雞蛋 中 I gY 效價(jià)。第 10天雞蛋測(cè)到抗體效價(jià)為 2。第 20天測(cè)的抗體效

9、價(jià)為 8, 隨后在第 30天效價(jià)聚增 , 到第 33天達(dá)到一峰值 , 第 34天 開始降低 , 第 45天降到最低 , 同一天加強(qiáng)免 疫一次。再隨后的 21天內(nèi)效價(jià)又重新達(dá)到 原來的峰值維持 3天后降低 , 結(jié)果表明 :前一 次免疫未達(dá)到理想結(jié)果 , 后一次免疫較成功 , 與免疫理論相符合。2. 2 診斷抗體與 I BD 病毒抗原以及風(fēng)疹病毒抗原擴(kuò)散 18小時(shí)左右 , 在兩孔間出 現(xiàn)一相對(duì)清晰白色的沉淀線 。 說明抗原抗體是有特異性的。而兩抗原 間的沉淀線也出現(xiàn)部分融合。通過 AGP 試 驗(yàn)方陣分析得到以雞 I BD 病毒為抗原的 , 最 高抗體效價(jià)達(dá)到 1:128, 以風(fēng)疹為 抗原的最 高效

10、價(jià)達(dá)到 1:20480。 2. 3 單擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)曲線 :取二抗 1:40稀釋度加入瓊脂糖 , 打孔 , 點(diǎn)入不同稀釋倍數(shù)的一抗。 48h 后觀察結(jié)果 見圖 , 測(cè)定沉淀環(huán)的直徑 , 以一抗?jié)舛葹闄M坐 標(biāo) , 沉淀環(huán)直徑平方為縱坐標(biāo)作圖 , 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖 2 單擴(kuò)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn) , 利用一元線性回歸 方程分析得到單擴(kuò)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=53. 172x +1. 6583相關(guān)性 R2=0. 9952。測(cè)得待測(cè)孔徑 7. 5mm, 故待測(cè)免疫球蛋白濃 度為 1. 027mg /ml。 圖 3 單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)示圖2. 4 抗風(fēng)疹病毒抗體效價(jià)檢測(cè) :利用酶聯(lián)免疫特異性強(qiáng)的特點(diǎn) ,

11、我們對(duì) 經(jīng)風(fēng)疹病毒免疫母雞在種齡均一 , 生長(zhǎng)發(fā)育 情況較一致 , 免疫后測(cè)不同雞蛋的效價(jià) , 結(jié)果 表明不存在太大的個(gè)體差異。該雞群未免疫 及傳染病史 , 不影響實(shí)驗(yàn)。自激活免疫后 , 定 時(shí)檢測(cè)雞蛋中 I gY 效價(jià)。第 20天測(cè)的抗體 效價(jià)開始增加 , 隨后在第 30天效價(jià)聚增 , 到 第 30天達(dá)到一 峰值 , 第 38天開 始降低 , 第 45天降到最低 , 隨后幾天內(nèi)效價(jià)峰值維持 , 結(jié)果表明 :免疫后產(chǎn)生的效價(jià)比較問題 , 且較 為理想 , 同時(shí)也體現(xiàn)了 ELI SA 反應(yīng)測(cè)定的準(zhǔn)確性。 圖 4 風(fēng)疹效價(jià)檢測(cè)圖 3 討 論(1 本次實(shí)驗(yàn)以雞 I BD 病毒以及風(fēng)疹病毒為抗原 ,

12、采用三次肌注免疫。分別為第 10天、 20天和 30天 , 且在二免后都出現(xiàn)抗體效 價(jià)。其中以雞 I BD 病毒為抗原的 , 最高抗體 效價(jià)達(dá)到 1:128, 以風(fēng)疹為抗原的最 高效價(jià)達(dá)到 1:20480, 由此 說明本次實(shí)驗(yàn) 的免疫程 序是可行的。(2 我們采用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附 法對(duì)免疫過程中的抗體活性的變化進(jìn)行了跟 蹤檢測(cè) , 結(jié)果表明 :瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)可以對(duì)免疫程序 建立提供參考 , 可以確定是否需要加強(qiáng)免疫。 同時(shí)對(duì)一些特異性抗原 , 我們采用 ELISA 法 檢測(cè) , 從實(shí) 驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) ELISA 檢 測(cè)過程 快速、簡(jiǎn)便 , 但 ELI SA 法的實(shí)驗(yàn)條件比較靈敏。所 以在用 ELIS

13、A 法檢測(cè)時(shí) , 一定要注意保持實(shí) 驗(yàn)操作的規(guī)范。(3 利用抗原免疫產(chǎn) 卵母雞 , 可以從其 所產(chǎn)卵分離得到多克隆 抗體 (Ig Y , 現(xiàn)已被 許多學(xué)者研究所證實(shí)。我們利用 RUV 抗原 免疫產(chǎn)卵母雞 , 從雞所產(chǎn)的卵中分離得到大 量抗 ! RUV Ig Y, 同時(shí)對(duì)該抗體的特異性鑒定 結(jié)果表明它的特異性 , 由此說明 :可以用雞作 為免疫動(dòng)物制備特異性多克隆抗體 Ig Y 。參考文獻(xiàn)1. 杜念興 . 獸醫(yī)免疫學(xué) , 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版 社 19952. 吳 敏 等 . 醫(yī) 學(xué)免 疫學(xué) , 中國(guó) 科學(xué) 技 術(shù)出 版社 19933. 鐘清萍 . 雞卵黃免疫球蛋白研究動(dòng)態(tài) , 生命科 學(xué) , 1998. 10(5 252-2544. 司傳平 . 醫(yī)學(xué) 免疫學(xué) 實(shí)驗(yàn) , 人民 衛(wèi)生 出版 社 , 19995. 王 德春 . 蛋白 免疫球 蛋白制備 和應(yīng)用 研究進(jìn) 展 , 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨 床生物 化學(xué) 與檢 驗(yàn)分 析手