偏頭痛風(fēng)熱證動物模型的建立_評價與藥物反證_姚卓亭

1、35第13卷 第4期 2011 年 4 月遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 13 No. 4 Apr . ,2011偏頭痛為神經(jīng)內(nèi)科臨床常見的一種原發(fā)性疾病,反復(fù)發(fā)作,遷延難愈,可極大程度影響患者的生活質(zhì)量并已造成全球范圍的醫(yī)療經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。本病西醫(yī)發(fā)病機制不明,多具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化表現(xiàn)。偏頭痛的中醫(yī)病因多為風(fēng)、火、痰、瘀、虛5種因素,本課題組前期針對19942005年中醫(yī)藥治療偏頭痛的文獻進行了研究1,并將各方藥按治法進行分類,統(tǒng)計各方藥的治療有效率,結(jié)果顯示“散偏湯”治療例數(shù)最多,有效率也較高,散偏湯主要治療風(fēng)熱型頭痛,兼有

2、疏肝理氣之效,因此推斷偏頭痛臨床證型以風(fēng)熱證型最多。本實驗嘗試建立偏頭痛風(fēng)熱證動物模型,使用芎芷地龍湯進行表征反證,力圖為偏頭痛中藥新藥開發(fā)搭建真正符合中醫(yī)藥作用特點的評價體系和評價平臺。1 材料與方法1.1 動物與分組清潔級SD 大鼠40只,體重150180g,由北京維通利華實驗動物研究所提供,合格證號:SCXK(京2005-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機分為正常組(n =8、硝酸甘油組(n =8、風(fēng)熱組(n =8、風(fēng)熱硝酸甘油組(n =8、中藥治療組(n =85組,每組各8只。動物飼養(yǎng)的室內(nèi)溫度2127,相對濕度45%55%。各組大鼠喂常規(guī)飼料,自由進食飲水。1.2 藥品實驗所用的芎芷地龍

3、湯藥用:川芎15g,白芷15g,生石膏(先下30g,地龍20g,元胡10g中飲片均購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房,自行按常規(guī)煎煮法煎煮并濃縮,每毫升含生藥1.8g;氯化鈉注射液500mL/袋,北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批偏頭痛風(fēng)熱證動物模型的建立、評價與藥物反證姚卓亭1,王玉來2,趙永烈2,高穎3(1.人民衛(wèi)生出版社,北京 100021;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700摘 要:目的:嘗試建立偏頭痛風(fēng)熱證動物模型。方法:使用熱風(fēng)及硝酸甘油協(xié)同誘導(dǎo)建立大鼠偏頭痛風(fēng)熱證模型,通過圖像采集、分析技術(shù)研究模型大鼠風(fēng)熱證生物表征(舌象、耳

4、廓、眼結(jié)膜的變化,并以芎芷地龍湯進行反證。結(jié)果:硝酸甘油組與風(fēng)熱硝酸甘油組舌灰度值與正常組有顯著差異(P <0.01,中藥治療組與硝酸甘油組相比略有差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05;肉眼觀察硝酸甘油組耳廓、眼結(jié)膜血管充血明顯;熱風(fēng)因素在本實驗中未對舌象、耳廓、眼結(jié)膜產(chǎn)生明顯影響。結(jié)論:硝酸甘油皮下注射可引起生物體征(舌象、耳廓、眼結(jié)膜的改變,偏頭痛風(fēng)熱證模型仍需進一步研究。關(guān)鍵詞:風(fēng)熱證;偏頭痛;硝酸甘油;證候模型中圖分類號:R747.2 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1673-842X (2011 04- 0035- 03收稿日期:2010-10-04基金項目:教育部博士點新教師基

5、金課題(200800261023;北京中醫(yī)藥大學(xué)科研課題作者簡介:姚卓亭(1984-,女,北京人,編輯,碩士,研究方向:中醫(yī)腦病。通訊作者:趙永烈(1975-,男,山西大同人,主治醫(yī)師,博士,研究方向:中醫(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與實驗研究。 E-mail:yongy3。Establishment Evaluation and Proof of a Novel Migraine AnimalModel Representing Wind-Heat SyndromeYAO Zhuo-ting 1,WANG Yu-lai 2,ZHAO Yong-lie 2,GAO Ying 3(1.People&

6、#39;s Medical Publishing House,Beijing 100021,China;2. Beijing University of TraditionalChinese Medicine Subsidiary Dongfang Hospital,Beijing 100078,China;3.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,ChinaAbstract:Objective :To try to establish a novel mi

7、graine animal model representing wind-heat syndrome. Method :Establishing rat model by having animals blew hot wind and GTN administration,taking pictures of rats' tongues,auricles and conjunctivae,analyzing the gray scale of rat tongues toevaluate the TCM syndrome and demonstrating the syndrome

8、 by Xiong Zhi Di Long Tang. Result :The gray scale level of tongue in GTN groups were significantly higher than control group(P <0.01;the gray scale level in medicated group was slightly lower than GTN groups(P >0.05. Observed by naked eyes,auricles and conjunctivae showed more blood vessel ne

9、twork than the control group. Wind-heat did notcause any significant difference between groups. Conclusion :GTN administration can cause changes in the manifestation of rat tongues,auricles and conjunctivae. The wind-heat syndrome model needs to be further considered to grow mature.Key words:wind-he

10、at syndrome;migraine;GTN;syndrome model遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報13卷號A200909154;硝酸甘油注射液5mg/mL,北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號20081025。1.3主要儀器電吹風(fēng) PHILIPS HP8200,佳能數(shù)碼相機PowerShot A710,Image J 1.36b圖像分析軟件。1.4模型制備與藥物干預(yù)實驗第1日開始每日早晨固定時間予風(fēng)熱組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組電吹風(fēng)吹熱風(fēng),1檔熱度,風(fēng)力1級,距離約45cm,溫度控制于3941,連續(xù)吹風(fēng)7日,第8日灌胃后30min予硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組皮下注射硝酸甘油10mg/k

11、g,復(fù)制實驗性偏頭痛動物模型,正常組、風(fēng)熱組則皮下注射等量的生理鹽水。實驗第5日開始灌胃給藥,連續(xù)4天,中藥治療組灌胃給芎芷地龍湯(10.8g/kg,其余組灌胃等量生理鹽水。1.5指標(biāo)觀測(1動物喂養(yǎng)7日內(nèi)的一般情況,包括活動情況、皮毛色澤、進食、大便性狀。(2觀察第8日皮下注射硝酸甘油或生理鹽水后各組大鼠行為改變,并計大鼠搔頭次數(shù)。(3皮下注射硝酸甘油或生理鹽水4h后各組麻醉下進行舌象、耳廓、眼結(jié)膜圖像采集。1.6舌象、耳廓、眼結(jié)膜圖像采集各組在皮下注射硝酸甘油或生理鹽水4h后給予1%戊巴比妥鈉60mg/kg腹腔麻醉,將照相機固定在體視顯微鏡架上,將體視顯微鏡光源調(diào)到最大。麻醉大鼠置于鏡架下

12、固定位置,用無齒鑷夾住舌尖位置,平行于桌面輕拉出舌,進行照相,耳廓均取右耳耳背面拍照,以鑷子輔助暴露下眼結(jié)膜;照相機置于手動模式,光圈8.0,快門1/100s,以體視鏡架焦距螺旋調(diào)焦。1.7圖像分析采用Image J 1.36b圖像分析軟件,操作步驟:打開Image J軟件。打開要分析的圖像。依次用鼠標(biāo)選取舌體正中部和中部兩側(cè)大小為30×30的三處區(qū)域。每次選取后采用Edit中Invert處理所選區(qū)域。運行Analyze中的measure,出現(xiàn)舌質(zhì)灰度值。1.8統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s表示,對數(shù)據(jù)進行正

13、態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗,若兩項檢驗均符合,使用單因素方差分析(One-way ANOVA統(tǒng)計,組間比較采用SNK檢驗,對不滿足任一檢驗的數(shù)據(jù),采用非參數(shù)檢驗中的多個獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗,組間比較采用Mann Whitney U法檢驗,均以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的界限。2 結(jié) 果2.1大鼠一般情況觀察各組大鼠在飼養(yǎng)期間均毛發(fā)光潔整齊,食欲可,行動靈活敏捷。風(fēng)熱組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組在吹熱風(fēng)時均有部分大鼠出現(xiàn)煩躁、籠內(nèi)站立、跳躍、鼻出血的情況。實驗開始吹風(fēng)處理前觀察各組大鼠大便,多為軟便、中等質(zhì)地或偏硬質(zhì)潤,開始吹風(fēng)后,風(fēng)熱組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥

14、治療組大鼠大便無軟便,少見中等質(zhì)地,多為偏硬質(zhì)潤或干硬便,而正常組與硝酸甘油組以中等便及偏硬質(zhì)潤便為多。2.2復(fù)制偏頭痛實驗動物模型后行為變化2.2.1 一般改變硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組皮下注射硝酸甘油后5min出現(xiàn)煩躁,活動增多,前肢及后肢頻繁搔頭,雙耳耳廓血管較正常組增粗,且血管增長直抵耳緣,中藥治療組煩躁、搔頭的表現(xiàn)較硝酸甘油組及風(fēng)熱硝酸甘油組少,3組在1h時基本安靜蜷臥,其后間斷活動,以蜷伏為主。注射硝酸甘油組的一般改變與文獻描述相符2,說明硝酸甘油偏頭痛模型復(fù)制成功。2.2.2 皮下注射后大鼠搔頭次數(shù)計數(shù)以前肢搔臉1次計1次,后肢快速搔頭動作從開始到停止計1次,人工觀察

15、計算每只大鼠皮下注射后至2h的搔頭次數(shù),以判斷實驗?zāi)Ｐ蛷?fù)制是否成功。結(jié)果:正常組(13.13±3.66次,硝酸甘油組(78.25±12.8次,風(fēng)熱硝酸甘油組(87.00±10.78次,風(fēng)熱組(18.25±5.04次,中藥治療組(51.00±14.42次。統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組大鼠搔頭次數(shù)高于正常組,且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;正常組、風(fēng)熱組、中藥治療組搔頭次數(shù)低于硝酸甘油組,且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01。風(fēng)熱組與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,風(fēng)熱硝酸甘油組與硝酸甘油組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P

16、>0.05。表1 各組2h內(nèi)搔頭次數(shù)(n=8,x±s組別 搔頭次數(shù)正常組 13.13±3.66硝酸甘油組78.25±12.8#風(fēng)熱硝酸甘油組 87.00±10.78#風(fēng)熱組 18.25±5.04中藥治療組 51.00±14.42#注:與正常組比較:#P<0.01;與硝酸甘油組比較:P<0.01。2.3大鼠舌象灰度值比較肉眼觀察正常組大鼠舌質(zhì)淡紅,余組顏色較正常組偏紅,組間差異肉眼無法進行分辨。舌面灰度值結(jié)果:正常組85.05±9.79,硝酸甘油組97.35±6.53,風(fēng)熱硝酸甘油組98.82

17、77;8.94,風(fēng)熱組90.63±4.21,中藥治療組91.89±7.50。統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘油組灰度值高于正常組,且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,風(fēng)熱組、中藥治療組灰度值高于正常組,低于硝酸甘油組與風(fēng)熱硝酸甘油組,但不具統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,硝酸甘油組與風(fēng)熱硝酸甘油組組間無明顯差異(P>0.05。表2 各組舌面灰度值的比較(n=8,x±s組別灰度值正常組85.05±9.79硝酸甘油組 97.35±6.53#風(fēng)熱硝酸甘油組 98.82±8.94#風(fēng)熱組90.63±4.21中藥治療組91.8

18、9±7.50注:與正常組比較:#P<0.05。2.4耳廓、眼結(jié)膜肉眼觀察皮下注射硝酸甘油的硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘3613卷遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報油組、中藥治療組耳廓漫紅,血管紋路明顯,而正常組與風(fēng)熱組耳廓整體顏色較淡,脈絡(luò)無其他3組明顯。皮下注射硝酸甘油的硝酸甘油組、風(fēng)熱硝酸甘油組、中藥治療組下眼結(jié)膜血絡(luò)充血明顯,色紅,而正常組與風(fēng)熱組眼結(jié)膜色淡紅,無充血現(xiàn)象。3 討 論(1偏頭痛風(fēng)熱證模型的建立與評價。中醫(yī)的“證”是疾病的病因、病位、病性、病機、邪正斗爭等的概括,是動態(tài)變化的,具有整體性、復(fù)雜性、籠統(tǒng)性和模糊性等特性,是辨證論治的起點和核心。建立證候模型是研究中醫(yī)證候?qū)W的重要途徑

19、之一,也是現(xiàn)今中醫(yī)科研的熱點難點之一。中醫(yī)證候模型是在中醫(yī)整體觀念及辨證施治思想指導(dǎo)下,運用臟象學(xué)說和病因病機理論,把人類疾病原型的某些特征在動物身上加以模擬復(fù)制而成,是中醫(yī)學(xué)人體證候的具體再現(xiàn)3。中醫(yī)證型動物模型可在中藥新藥開發(fā)中發(fā)揮重要作用,幫助搭建真正符合中醫(yī)藥作用特點的評價體系和評價平臺,推進我國自主創(chuàng)新中藥的發(fā)展。病證結(jié)合動物模型是證候動物模型發(fā)展的必然趨勢4,而目前公認(rèn)的思路是采取中醫(yī)病因因素結(jié)合西醫(yī)病理因素造模,并力求在動物的生物表征,如舌象、唇象、爪象、耳輪、尾尖、眼球、毛皮及動物行為等表現(xiàn)上模擬人的表征,并采用方藥反證法加以驗證,即遵循因-脈-證-治的思路5。目前中醫(yī)風(fēng)熱證相

20、關(guān)動物模型均使用于上呼吸道感染及肺炎相關(guān)研究中,造模方法有化學(xué)藥物致咳、致發(fā)熱、致局部炎癥等,這些造模方法均屬按西醫(yī)疾病機制建立模型,模擬病理變化,與中醫(yī)傳統(tǒng)病因意義的“風(fēng)熱證”差距很大,可以說,目前尚無符合中醫(yī)病因病機理論的風(fēng)熱證動物模型。故本課題采用中醫(yī)病因因素?zé)犸L(fēng)結(jié)合西醫(yī)病理因素硝酸甘油聯(lián)合建立偏頭痛風(fēng)熱證動物模型,通過觀察動物生物表征,如一般情況、舌象、耳廓、結(jié)膜來評價其與臨床風(fēng)熱證證候的相似度,并使用祛風(fēng)清熱之芎芷地龍湯進行反證以確定模型的證屬性。本研究造模思路符合中醫(yī)理論及臨床實際。本實驗大鼠皮下注射硝酸甘油后行為改變符合文獻描述2,統(tǒng)計搔頭次數(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)搔頭次數(shù)作為硝酸甘油偏頭痛

21、動物模型行為學(xué)觀察的評定指標(biāo)具有可量化、客觀的優(yōu)點。同時表明芎芷地龍湯能明顯改善偏頭痛動物模型的行為學(xué)癥狀,減少動物的陽性反應(yīng)次數(shù),具有一定的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用,符合課題組前期研究結(jié)論1。在舌象灰度值方面,本實驗結(jié)果風(fēng)熱硝酸甘油組與硝酸甘油組、正常組與風(fēng)熱組舌象灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義,即風(fēng)熱因素對于大鼠的影響在本實驗中表現(xiàn)不明顯?？紤]可能由以下原因造成:(1硝酸甘油有擴血管作用,皮下注射硝酸甘油后動物活動增多,煩躁,且具有耳廓發(fā)紅、結(jié)膜充血等表征,從中醫(yī)理論角度可將硝酸甘油歸為熱性藥,而硝酸甘油所造的模型可看做是一個熱證模型,可能掩蓋熱風(fēng)的造模因素對于動物的表征影響,這可能是風(fēng)熱硝酸甘油組與硝酸甘油

22、組舌象、耳廓、結(jié)膜差別不顯著的原因。(2中醫(yī)病因造模因素強度及穩(wěn)定性可能不夠,這可能是風(fēng)熱組較正常組無明顯差異的主要原因。由于沒有可借鑒的風(fēng)熱證模型,本實驗造模屬于探索性嘗試,予大鼠連續(xù)吹熱風(fēng)7天,每天2h,并使用溫度計監(jiān)測控制籠內(nèi)溫度在3941。有幾種因素可能導(dǎo)致造模因素效果不顯著。電吹風(fēng)影響范圍局限。由于電吹風(fēng)的風(fēng)束以一定角度吹入籠中,客觀上會導(dǎo)致籠內(nèi)熱量分配不均,溫度計僅能固定監(jiān)測籠內(nèi)一點的溫度,而大鼠會傾向于聚集在溫度最低處,這客觀上減弱了熱風(fēng)對于動物的影響。在課題經(jīng)費及條件允許的情況下以后可考慮使用鼓風(fēng)干燥箱或氣候箱等設(shè)備進行造模以增加造模因素的穩(wěn)定性。造模因素強度不夠。本實驗予大鼠吹熱風(fēng)7天,每天2h,影響強度可能不足,今后可嘗試增加造模日數(shù)并采用每天間隔吹風(fēng)2次的方法增加強度,具體條件需要進一步摸索。單因素造模影響強度不夠。本實驗在中醫(yī)病因方面屬單因素造模,給予熱風(fēng)外因,而臨床一般認(rèn)為偏頭痛發(fā)病基礎(chǔ)為氣血虛弱,肝臟疏泄失常,加之感受風(fēng)寒濕外邪發(fā)病,故肝失疏泄為偏頭痛發(fā)生的重要內(nèi)因。在造模中可考慮結(jié)合慢性情志應(yīng)激與風(fēng)熱外襲兩種病因因素,具體操作上可引入目前使用較多的慢性束縛應(yīng)激模型,在造模過程中每日給予熱風(fēng)因素,雙因素造模可同時模擬偏頭痛發(fā)生的內(nèi)外因,其對于大鼠表征的改變可能更為明顯