免疫組化在血液腫瘤病理診斷中的應(yīng)用及意義

1、精選文檔免疫組化在血液腫瘤病理診斷中的應(yīng)用及意義(一)IHC方法相對簡單，但從取材到發(fā)報告之間環(huán)節(jié)較多，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能造成檢測結(jié)果偏差，甚至導(dǎo)致漏診、誤診。除IHC染色常規(guī)注意事項外，血液腫瘤標(biāo)本的檢測還有其特殊性。1.標(biāo)本的前期處理血液系統(tǒng)疾病病理診斷標(biāo)本，主要是淋巴結(jié)、脾臟和骨髓組織。與其它組織相似，造血細(xì)胞表面抗原不同其穩(wěn)定性會有差異，從而對固定劑的耐受性不同。組織固定的原則，是采用10%中性福爾馬林作為固定劑，固定時間最好不超過24小時。(1)淋巴結(jié)：取材后迅速固定，待組織表面變硬即可修塊。以淋巴結(jié)大小為直徑，厚度不超過3mm，以使組織得到充分的固定。如淋巴結(jié)中有淤血、壞死成分，

2、應(yīng)盡量除去。組織制片中的每個步驟都應(yīng)嚴(yán)格掌握，以免破壞組織的抗原活性。(2)脾臟：脾臟組織較大，應(yīng)注意多點取材；脾臟又是貯血器官，含血量多，取材時應(yīng)盡量除去積血；取材大小以2X2X7.5px為宜，取材后盡快固定。在多塊標(biāo)本中，病理醫(yī)師應(yīng)根據(jù)HE切片，挑由病變明顯的12塊作IHC染色。(3)骨髓組織：特點為組織小，主要為骨質(zhì)，造血細(xì)胞充斥于骨小梁之間。在組織制片的每個步驟都應(yīng)相應(yīng)縮短時間。骨髓組織制片需要脫鈣，酸性脫鈣液對抗原活性有影響，常規(guī)采用的2%硝酸，脫鈣不應(yīng)超過3小時。EDTA脫鈣液偏堿性，比較溫和，效果較好，只是時間長，約需2448小時。(4)骨髓涂片：某些情況下當(dāng)骨髓組織取材不好，如

3、太小或組織為骨皮質(zhì)、血凝塊等不能進(jìn)行石蠟包埋制片時，可用骨髓涂片代替。但注意骨髓涂片不能太厚，最好不混血。涂片稍干后用甲醇：丙酮(1：1)固定90秒后染色。涂片不能在室溫下久存。(5)外周血涂片：某些特殊情況不能采用穿刺骨髓取材時，可用外周血涂片代替。前提是外周血有核細(xì)胞總數(shù)必須較多，結(jié)果才相對可靠，固定同骨髓涂片。(6)組織印片：當(dāng)疾病診斷和分型必需的標(biāo)記物不能用于石蠟切片時，可用組織印片來補救。將新鮮軟組織取材后，按取材大小平放于干凈的載玻片上，輕壓，然后垂直取下標(biāo)本，組織表面的細(xì)胞即印在玻片上，風(fēng)干，固定同骨髓涂片。組織印片與冰凍切片相似，由于形態(tài)不好，除特殊情況外，臨床上盡量不用。2.

4、IHC所采用的檢測系統(tǒng)IHC染色方法很多，如免疫熒光、免疫酶標(biāo)、免疫金標(biāo)。免疫酶標(biāo)是以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用后，加入酶的底物生成有色產(chǎn)物，通過光鏡對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位。免疫酶標(biāo)以其標(biāo)記酶不同又分為標(biāo)記過氧化物酶(HRP)法，如ABC、SP及相應(yīng)二步法；標(biāo)記堿性磷酸酶(AP)法，如SAP及相應(yīng)的二步法。葡萄糖氧化酶(GOD)分子量較大，具有較多的氨基酸，在標(biāo)記時易形成廣泛的聚合，影響酶活性，現(xiàn)已較少使用。目前最常用的是SP、SAP及二步法。脾臟、淋巴結(jié)切片IHC染色可采用SP及相應(yīng)的二步法，DAB顯色。此法敏感性高，陽性定位準(zhǔn)，保存時間長。而骨髓中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核組織細(xì)胞含

5、有豐富的內(nèi)源性HRP、H2O2處理效果不理想，可造成非特異著色而影響結(jié)果的分析。故在做骨髓切片、骨髓涂片、外周血涂片染色時，我們常選擇AP標(biāo)記的SAP及相應(yīng)的二步法，核固紅或BcLP/NBT顯色。此系統(tǒng)敏感性尚好，但定位不及SP法，保存時間較短。3.抗體的選擇抗體的正確選擇是IHC染色的關(guān)鍵。血液系統(tǒng)腫瘤免疫分型主要用CD系列的白血病分化抗原?？紤]到患者對檢測費用的承受能力，在病理診斷中，主要采用認(rèn)真而全面的HE形態(tài)學(xué)觀察提出初步診斷與鑒別診斷意見，再據(jù)此選擇適應(yīng)的抗體。這就需要病理醫(yī)師準(zhǔn)確掌握各種抗體的作用，適應(yīng)范圍和可能發(fā)生的交叉反應(yīng)。選擇抗體的原則是：(1)當(dāng)造血系統(tǒng)腫瘤(主要是淋巴瘤)

6、與其它非造血系統(tǒng)未分化小細(xì)胞腫瘤難以區(qū)分時，首先選用LCA、NSE、CK等抗體組合，以確定腫瘤的組織來源。(2)病理診斷需作IHC來輔助診斷與鑒別診斷時，要根據(jù)組織形態(tài)學(xué)，考慮首選的抗體與鑒別診斷的抗體，首選抗體中至少應(yīng)用兩個以上的抗體聯(lián)合檢測。鑒別診斷的抗體應(yīng)選敏感性強(qiáng)及廣譜的抗體。(3)抗體的敏感性、特異性有很大差別，在選擇抗體時，要兼顧到這兩個方面。如T細(xì)胞淋巴瘤，選擇敏感性好的CD45R0與特異性強(qiáng)的CD3組合。同時，由于現(xiàn)有檢測抗體并非白血病細(xì)胞特異性試劑，而是針對不同人血細(xì)胞分化抗原的單抗，因此進(jìn)行分型時，需要配套抗體聯(lián)合使用、綜合分析、統(tǒng)一判斷。4.檢測結(jié)果的分析IHC染色理想的

7、結(jié)果是：陽性反應(yīng)部位明確、色澤鮮艷、背景清晰、對比度好。但由于諸如石蠟制片質(zhì)量、不同組織內(nèi)源性因素、不同廠家、不同批號抗體質(zhì)量的差異、抗原修復(fù)方式等因素的影響，染色結(jié)果并不一定理想。所以病理醫(yī)師在分析結(jié)果時，首先要分清陽性細(xì)胞是反應(yīng)性細(xì)胞，殘留細(xì)胞還是腫瘤性細(xì)胞，在確定陽性腫瘤細(xì)胞后，一般根據(jù)以下幾方面綜合分析，得出正確的診斷。(1)陽性定位：陽性細(xì)胞的定位是IHC診斷的重要依據(jù)。不同抗原陽性表達(dá)可分別定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或膜/質(zhì)、核/質(zhì)等不同部位，不在特定部位表達(dá)應(yīng)視為陰性。(2)陽性強(qiáng)度和陽性率：依據(jù)歐洲EGIL免疫分型建議，如果正常細(xì)胞成分在骨髓和外周血中只占極少部分時，具有某些

8、分化相關(guān)抗原的髓系細(xì)胞20%、淋系細(xì)胞30%則考慮白血病細(xì)胞。但也不能僅依靠陽性率的高低作為分型的唯一依據(jù)。某一種標(biāo)記只要是瘤細(xì)胞，即使數(shù)量不多亦可作為分型依據(jù)。陽性強(qiáng)度取決于細(xì)胞中抗原含量的多少，也與腫瘤細(xì)胞分化的不一致性有關(guān)，致使陽性表達(dá)有強(qiáng)弱之分。(3)陽性細(xì)胞的分布：骨髓及外周血涂片、骨髓組織切片，在多數(shù)情況下，陽性標(biāo)記瘤細(xì)胞呈彌漫性或散在性均勻分布，偶見小灶性分布，如轉(zhuǎn)移癌、淋巴瘤累及骨髓的部分類型。故陽性結(jié)果常以計數(shù)陽性率來表示。如陽性標(biāo)記細(xì)胞有形態(tài)上的異常再加以注明。而脾臟、淋巴結(jié)細(xì)胞密度大，正常情況下T、B淋巴細(xì)胞有一定的分布區(qū)域，一般B淋巴細(xì)胞占整個淋巴細(xì)胞群體的2550%,

9、T淋巴細(xì)胞約占5075%。不同類型淋巴瘤細(xì)胞分布也不同，所以計數(shù)百分率不完全準(zhǔn)確。確定單克隆性增生：大多數(shù)情況下，T或B陽性瘤細(xì)胞占絕對優(yōu)勢，在正常應(yīng)該分布較少的區(qū)域也廣泛增生；有時T、B兩系均有不同程度表達(dá)，可能是由于交叉反應(yīng)或雙標(biāo)記所致，應(yīng)選擇更特異的抗體檢測；個別情況下T、B標(biāo)記均不滿意，則以HE瘤細(xì)胞形態(tài)特點來確定類型。陽性細(xì)胞數(shù)量只是諸多判定因素之一，陽性瘤細(xì)胞的分布和形態(tài)是淋巴瘤分型的重要依據(jù)，如濾泡性淋巴瘤生發(fā)中心BcL-2陽性；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤性大細(xì)胞CD20陽性及生發(fā)中心BcL-6陽性；霍奇金淋巴瘤H/RS細(xì)胞CD30陽性均具有診斷意義。(4)如何區(qū)別特異性與非特異性反

10、應(yīng)：IHC染色結(jié)果有時并不理想。如何區(qū)別特異性與非特異性結(jié)果，得出科學(xué)的結(jié)論呢？一般來說，特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定部位，多定位于單個細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布，由于細(xì)胞內(nèi)含抗原量不同，表現(xiàn)在同一切片上出現(xiàn)不同強(qiáng)度的陽性染色結(jié)果。非特異性反應(yīng)常表現(xiàn)為：無一定的分布規(guī)律，陽性不限于單個細(xì)胞，而在某一部位成片均勻著色；細(xì)胞和周圍結(jié)締組織無區(qū)別；組織邊緣及皺折處呈現(xiàn)很強(qiáng)的染色。二、IHC在腫瘤組織細(xì)胞來源鑒別中的應(yīng)用腫瘤組織來源的鑒別僅適用于靠形態(tài)學(xué)不能確定來源的異常細(xì)胞。最常見為惡性未分化小細(xì)胞腫瘤的鑒別。波形蛋白Vimentin在很多腫瘤中都可表達(dá)，特異性較差，必要時

11、加做肌源性標(biāo)記物如myosin、Desmin等。值得注意的是：并不是所有血液系統(tǒng)腫瘤LCA均為陽性。樹突狀細(xì)胞肉瘤、淋巴母細(xì)胞淋巴瘤常不表達(dá)；少數(shù)間變性大細(xì)胞淋巴瘤、NK/T細(xì)胞淋巴瘤LCA也可陰性；霍奇金淋巴瘤亦不表達(dá)。故不能因為LCA陰性而完全排除淋巴瘤的可能。在排除了其它組織來源的基礎(chǔ)上，可考慮增加其它抗體檢測。三、IHC在血液系統(tǒng)良惡性疾病鑒別中的應(yīng)用組織形態(tài)學(xué)診斷中最易誤診的血液系統(tǒng)良惡性疾病主要是淋巴組織反應(yīng)性增生與惡性淋巴瘤，誤診率可高達(dá)1030%；如淋巴濾泡反應(yīng)性增生與濾泡性淋巴瘤。利用特異性單抗IHC染色，往往能達(dá)到較理想的鑒別效果。B淋巴細(xì)胞在分化的大多數(shù)階段存在細(xì)胞表面免

12、疫球蛋白(SIg),每個B細(xì)胞可表達(dá)一種以上Ig重鏈，但只表達(dá)一種Ig輕鏈，K或入。正常B細(xì)胞群體分泌的Ig輕鏈K和入比例為2:1。淋巴組織反應(yīng)性增生為良性多克隆性增生，B淋巴細(xì)胞同時表達(dá)K和入。當(dāng)淋巴組織發(fā)生腫瘤性增生時，起自單個克隆的B淋巴細(xì)胞則單一性表達(dá)K或入，兩者比例可達(dá)1：10以上。因此，Ig不僅能證實B細(xì)胞來源，而且限制性輕鏈表達(dá)又是鑒別B細(xì)胞腫瘤的重要依據(jù)之一。但實踐中Kappa、Lambda這兩種標(biāo)記物并不理想，正常漿細(xì)胞可陽性，B細(xì)胞腫瘤有時陽性檢出率較低。因此，該標(biāo)記物陰性者不能完全排除B細(xì)胞惡性淋巴瘤，應(yīng)結(jié)合其它B細(xì)胞標(biāo)記。還有3040%的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴

13、瘤不表達(dá)Ig輕鏈。當(dāng)缺乏Ig輕鏈而全B標(biāo)記陽性時，常考慮腫瘤的可能。診斷確有困難時，輔以Ig重鏈(IgH)基因重排檢測，可以有助于診斷。T-淋巴瘤缺乏克隆性標(biāo)記抗體，可選用全T細(xì)胞標(biāo)記物來鑒別。T淋巴細(xì)胞絕大部分表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7,同時CD4與CD8之比約15:1，極少有CD4-/CD8-或CD4+/CD8+的情況。當(dāng)增生的T細(xì)胞CD4/CD8比例增大或縮小，或出現(xiàn)雙陰性，雙陽性，或丟失一個或多個全T細(xì)胞抗原時，應(yīng)高度懷疑T細(xì)胞淋巴瘤。必要時，TCR受體基因重排有助于診斷。3040%的濾泡性淋巴瘤(FL)不表達(dá)Ig輕鏈，與淋巴濾泡反應(yīng)性增生的鑒別，主要靠BcL-2來實現(xiàn)。正常淋

14、巴組織中。套區(qū)小B細(xì)胞，T區(qū)大部分細(xì)胞表達(dá)BcL-2而濾泡中心細(xì)胞不表達(dá)。FL時，腫瘤性淋巴濾泡生發(fā)中心細(xì)胞則BcL-2陽性。CD10強(qiáng)陽性表達(dá)也有助于兩者的鑒別。診斷仍有困難時，BcL-2/JH融合基因重排陽性有助于FL的診斷。四、IHC在髓系腫瘤病理診斷中的應(yīng)用髓系白血病的免疫分型，是基于正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過程中，細(xì)胞中抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)。這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病細(xì)胞仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白血病進(jìn)行分型。1 .急性髓系白血病是髓系惡性腫瘤的主要類

15、型。目前，商品化的髓系抗體針對髓細(xì)胞分化的階段性不十分明顯，加上一些抗體不能用于石蠟切片或效果不好，使髓系白血病免疫分型在病理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制，BM石蠟包埋組織IHC染色對鑒別AML各亞型雖有一定幫助，但目前還不能用抗體鑒別AMLMOM5各亞型，須結(jié)合其它檢查綜合分析，才能作出正確的診斷。詳見流式細(xì)胞術(shù)在血液腫瘤診斷中的應(yīng)用相關(guān)章節(jié)。2.組織細(xì)胞腫瘤組織細(xì)胞腫瘤是軟組織中由起源于骨髓原始單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的巨噬細(xì)胞異常增生所形成的腫瘤，臨床上常見的幾種類型有：性組織細(xì)胞增生癥（惡組）：惡組是全身性單核一巨噬細(xì)胞的惡性增生性疾病，表達(dá)CD68、Lysozyme等組織細(xì)胞標(biāo)記物。隨著對本病細(xì)胞起源的認(rèn)識，目前認(rèn)為：惡組實際上一部分是T細(xì)胞淋巴瘤，一部分是同時表達(dá)T細(xì)胞抗原的間變性大細(xì)胞淋巴瘤，真正起源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是極少的，所以，此種疾病基本上已歸入T細(xì)胞淋巴瘤的范疇。組織細(xì)胞肉瘤：瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)組織細(xì)胞抗原CD68、Lysozyme,同時還表達(dá)CD11C、CD14、CD45，而MPO、CD33常陰性。B細(xì)胞標(biāo)記和CD3也常陰性，但CD4可表達(dá)。朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥/朗格漢斯細(xì)胞肉瘤：CD1a是Langerhan's細(xì)胞特異性標(biāo)記物，因此，強(qiáng)表達(dá)CD1a和S100，CD