切向流過濾制備抗豬繁殖與呼吸綜合征豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液及其質(zhì)量評價

1、切向流過濾制備抗豬繁殖與呼吸綜合征豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液及其質(zhì)量評價隨著我國規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬群飼養(yǎng)密度加大、免疫抑制病、飼料霉菌毒素等諸多原因?qū)е仑i群免疫功能低下,使豬群抵抗力差、疫苗免疫后不能產(chǎn)生有效保護,甚至免疫失敗時有發(fā)生,讓我國養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大風(fēng)險。其中,豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是一種重要的免疫抑制性疾病,已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。我國主要以疫苗免疫來防控PRRS顯示出一定效果，但至今我國PRRS勺防控依然面臨巨大壓力。為提高PRRS5苗免疫效力，PRRS5苗免疫佐劑的研發(fā)是一項重要工作。轉(zhuǎn)移因子(T

2、ransferFactor,TF)是一種免疫增強佐劑,對于抗體或者抗生素控制不力的傳染病及免疫缺陷疾病的預(yù)防起到重要作用。但目前國內(nèi)獸用TF的生產(chǎn)均為非特異性TF(NonspecificTF，NTF)。在這不M#形下，抗PRRS特異性TF(SpecificTFagainstPRRS,PRRS-STF)的制造工藝及其質(zhì)量評價將成為TF研發(fā)、生產(chǎn)的方向。基于此,本研究擬建立逐級切向流過濾技術(shù)生產(chǎn)PRRS-STF,t制備過程中的各項技術(shù)條件進行優(yōu)化，為PRRS-STF勺大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的參考依據(jù)，并對應(yīng)用該工藝制備的PRRS-STF進行質(zhì)量評價。1.PRRS-STF勺制備及檢驗研究本試驗從PRR凱

3、體陽性的免疫健康豬群，選取無牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、PRR則毒(PRRSV)口蹄疫病毒(FMDV偽狂犬病病毒(PRV)污染的豬脾臟，探索建立了PRRS-STF勺規(guī)?；圃旃に嚭吞禺愋孕Яz驗方法（白細胞粘附抑制法），并對實驗室試制的3批等滲PRRS-ST進行了檢驗。結(jié)果顯示,3批PRRS-ST多肽含量、核糖含量、脫E受體法效力檢驗非特異性效力和白細胞粘附抑制法效力檢驗特異性效力均較接近,分別達到2.5mg/mL以上、55g/mL以上、12%Z上和30%Z上；鑒別檢驗時PRRS-STF勺OD260nm/OD280S0

4、rtm值均大于1.9且均在250nm260nm處有最大吸收峰，內(nèi)毒素含量均不超過10EU/mL;蛋白質(zhì)定性檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗（包括BVDVPPVCSFVPCV-2、PRRSVFMDVPRV致細胞病變檢驗和紅細胞吸附性外源病毒檢驗）結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明,3批PRRS-ST具有抗PRRSI異性，其多肽含量、核糖含量、脫E受體法效力檢驗非特異性效力等指標(biāo)均遠高于TF人醫(yī)國家標(biāo)準(zhǔn)（轉(zhuǎn)移因子注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)）和獸用現(xiàn)行最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（三類新獸藥），且中性等滲、無滅活劑殘留的工藝效果使PRRS-STFS于與PRRS活疫苗的聯(lián)合免疫。2.PRRS-STF勺

5、切向流過濾工藝研究在生物制藥中切向流過濾技術(shù)從純化、澄清、濃縮到目標(biāo)分子的分離均應(yīng)用廣泛,而TF的分離工藝是TF制備的關(guān)鍵技術(shù)?；诖?，本試驗通過0.1m20.22仙m切向流微濾和0.1m25KD切向流超濾研究膜透壓（TMP）、進液流量、濃縮倍數(shù)和透析倍數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)對膜通量（Flux）的影響，確定上述切向流工藝關(guān)鍵參數(shù)。并將參數(shù)線性放大于2m2微濾、2.5m2超濾系統(tǒng)制備5批PRRS-ST電傳統(tǒng)Lawrence方法制備的5批PRRS-ST進行工藝過程、檢驗結(jié)果（性狀、鑒別檢驗、蛋白質(zhì)定性檢驗、多肽含量、核糖含量、脫E受體法效力檢驗非特異性效力和白細胞粘附抑制法效力檢驗特異性效力）對比。結(jié)果顯示

6、，切向流過濾最佳條件為：進液流量、TMP濃縮倍數(shù)、透析倍數(shù)和平均Flux,在0.22仙m微濾時分別為9.3L/min/m2、2Psi、3倍、0.5倍和11LMH;在5KD超濾時分別為5L/min/m2、19.5psi、6倍、1倍和51LMH線性放大后的Flux曲線與0.1m2時接近。切向流過濾方法制備的PRRS-ST多肽含量、核糖含量、脫E受體法效力檢驗非特異性效力和白細胞粘附抑制法效力檢驗特異性效力均高于傳統(tǒng)Lawrence方法,且用時減少24h左右。結(jié)果表明，切向流過濾方法線性放大良好、生產(chǎn)效率高，所制備PRRS-STFT效成分含量和活性高。3.PRRS-STF的除病毒工藝研究本試驗采用不

7、同終濃度B-內(nèi)內(nèi)酯（0.1%、0.02%、0.01%、0.005%）對含有PPV的離心上清液（PPV終毒價為105TCID50/mL）進行不同時間（12h、24h、36h、48h）的滅活，滅活后樣品經(jīng)37c水解2h,采用豬睪丸ST細胞培養(yǎng)及三代盲傳觀察細胞病變，對第3代細胞培養(yǎng)物采用間接免疫熒光抗體法檢驗滅活效果。結(jié)果顯示，12h48h內(nèi),0.1%、0.02%?口0.01%0-丙內(nèi)酯PPV僉驗結(jié)果均為陰性;48h內(nèi),0.005%B-丙內(nèi)酯PPV僉驗結(jié)果為陽性?？紤]確保產(chǎn)品的安全性，因此規(guī)定：終濃度為0.01%的B-丙內(nèi)酯在28c下滅活24h,滅活后置于37c下水解2h。本試驗還采用5KD超濾膜

8、對分別含有終毒價為106TCID50/mLPCV-2、PRRSV和PRV勺微濾透過物進行超濾，PCV-2組的超濾透過物采用豬腎PK-15細胞培養(yǎng)和三代盲傳，對第3代細胞培養(yǎng)物采用間接免疫熒光抗體法檢測，而PRRSV1、PRV組的微濾透過物采用PCR!行檢測。結(jié)果顯示，PCV-2、PRRSVPRV僉驗結(jié)果均為陰性。這些結(jié)果表明，B-丙內(nèi)酯和5KD超濾膜等除病毒工藝確保了PRRS-ST比外源病毒污染。4.PRRS-STFI勺藥理學(xué)研究本試驗采用試制的3批PRRS-STF8行藥理活性研究,結(jié)果顯示,3批PRRS-STFS家兔熱原檢查、小鼠異常毒性檢查和豚鼠過敏反應(yīng)檢查均合格；家兔E玫瑰花試驗時實驗組

9、E玫瑰花結(jié)百分率(23.3%、23.6%和26.2%)均顯著高于對照組(13.2%)(P<0.05);小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗時實驗組月中脹度(14.3、14.5及15.8mg典顯著高于對照組(9.8mg刖空白組(0.5mg)(P<0.05);小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗時實驗組吞噬百分率(30.50%、30.83%、31.17%)及吞噬指數(shù)(0.68、0.67、0.71)均顯著高于對照組(21.33%及0.45)(P<0.05);小鼠碳粒廓清試驗時實驗組巨噬細胞K均值(0.0455、0.0487、0.0492)及a均值(6.97、6.95、7.39)均顯著

10、高于對照組(0.0263及5.97)(P<0.05)。結(jié)果表明，PRRS-STFW顯著提高T淋巴細胞及巨噬細胞活性，促進T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，提高機體免疫功能。5.PRRS-STFI勺安全性研究本研究開展了PRRS-ST印獨注射及與PRRSS疫苗聯(lián)合免疫注射的安全性試驗，對1日齡仔豬、46周齡保育豬、懷孕30天左右母豬、產(chǎn)前30天左右母豬和種公豬采用實驗室試制的3批PRRS-ST分別進行一次單劑量、重復(fù)單劑量和一次超劑量單獨肌肉注射。止匕外，還對34周齡仔豬、配種前1周左右母豬和種公豬進行了一次單劑量、一次超劑量的PRRS-STFfPRRS舌疫苗聯(lián)合免疫肌肉注射。結(jié)果顯示

11、,PRRS-STF單獨注射及與PRRS舌疫苗聯(lián)合免疫注射的仔豬、保育豬、母豬和種公豬均沒有不良反應(yīng)，注射PRRS-STF勺母豬分娩后產(chǎn)仔情況與非PRRS-STIS射組相比無差異，仔豬以及保育豬的平均日增重均高于非PRRS-STFi射組但差異不顯著(P>0.05)表明PRRS-STF寸仔豬、保育豬、母豬和種公豬均安全。6.PRRS-STFI勺效力研究本試驗通過PRRS-STF寸豬淋巴細胞轉(zhuǎn)化率（MTT法檢測）和E玫瑰花結(jié)百分率,PRRS舌疫苗免疫豬PRRS啦體水平（Elisa法才測）、IFN-丫含量（液相芯片平臺技術(shù)LuminexX-MAPt檢測）和外周血淋巴細胞（Lym）、T淋巴

12、細胞、CD4+CD8+雙陽性T（DPT）淋巴細胞、CD4-CD8雙陰性T（DNT）淋巴細胞數(shù)量及比值（流式細胞技術(shù)絕對與相對計數(shù)法）,PRRS活疫苗攻毒保護力的影響研究，對試制的PRRS-ST敢力進行評價。結(jié)果顯示，單獨注射PRRS-STFT提高豬淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和E玫瑰花結(jié)百分率，提高豬免疫功能；聯(lián)合注射PRRS-STFT提高PRRSS疫苗（CH-1R株）免疫豬PRRSV抗體水平和IFN-丫含量，提高PRRSS疫苗的免疫效果。PRRS-STFT提高PRRS活疫苗（CH-1R株）攻毒保護力，對高致病性PRRSV（HighlyPathogenicPRRSV,HP-PRRSV）TJ-F5的攻毒保護率由單獨免疫豬攻毒保護率40%!高到聯(lián)合免疫豬攻毒保護率達80%。免疫后3d至21d實驗組DPT細胞數(shù)量、DPT/T比值高于其他兩組,而免疫后7d至21d實驗組DNT細胞數(shù)量、DNT/T比值始終低于其他兩組；攻毒后第3d,各組Lym、T、DPT和DNT細胞數(shù)量均顯著降低（P<0.01）,此時各組Lym、T、DPT和DNT細胞數(shù)量和DPT/T、DNT/T比值分別為攻毒前均值的35%、38%、27%51%口72%134%;至攻毒后第28d,各組存活豬LymT、DPT和DNT細胞數(shù)量和DPT/T、DNT/T比值分別為攻毒前均值的72%、60%、122%、36%和197%、5