色譜和毛細管電泳在中藥現(xiàn)代化過程中的作用

1、色譜和毛細管電泳在中藥現(xiàn)代化過程中的作用眾所周知，中藥現(xiàn)代化有一個必須解決的關鍵問題就是質量控制標準。雖然目前西方發(fā)達國家醫(yī)藥市場已逐漸開始接受天然復方藥物，承認中藥復方的臨床療效和安全性，但是，如何有效控制中藥的質量仍然是一個尚未解決的問題，這在很大程度上限制了中藥的臨床應用，阻礙了中藥的國際化進程。鑒于中藥本身的藥理特性和成分復雜性，加之目前藥材來源的多樣性、生產(chǎn)工藝的不規(guī)范和分析要求的特殊性，美國食品藥品管理局（MND）、世界衛(wèi)生組織（OJC）、歐共體、英國、印度和加拿大草藥典E均接受指紋圖譜作為申報材料的組成部分。不過，這大多是針對保健性植物藥的，對于臨床用藥品則尚無此類規(guī)定。因此，中

2、藥的質量控制標準仍是一個亟待解決的國際性難題。這無疑是一個嚴峻的挑戰(zhàn)，但同時又是我們在該領域做出世界領先水平工作的契機。從!"世紀9"年代將薄層掃描圖譜用于中成藥分析，到&"年版中國藥典設置薄層色譜鑒別對照藥材，再到!"""年國家藥品監(jiān)督局發(fā)布“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）”，我國中醫(yī)界對指紋圖譜在中藥質量控制中的作用已經(jīng)達成了重要的共識，并提出了色譜指紋圖譜(和中藥材特征性總成分指紋圖%等概念，已有不少JKL9、I8、核磁共振（PQG）、紅外光 譜（MRSG）和熒光光譜&"等技術用于指紋圖譜分析

3、的報道。指紋圖譜不要求呈現(xiàn)在圖譜中的每一個組分的化學結構都清楚，也不要求對每個組分都精確定量，但要求圖譜具備指紋特征，即專屬、穩(wěn)定、實用，憑借指紋圖譜可確認產(chǎn)品的真?zhèn)?，且能判斷質量穩(wěn)定與否&&。現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展已可提供用于指紋圖譜分析的強有力技術，特別是色譜和毛細管電泳這樣的分離分析方法及其與質譜的聯(lián)用技術，可以提供多維的數(shù)據(jù)。比如采用毛細管柱I或頂空氣相色譜（JFI）可以獲得中藥中可揮發(fā)性成分的譜圖&!；采用裂解氣相色譜（K>$I）可以獲得藥物成分降解產(chǎn)物的信息&#；采用 JKL&E，&(則可以獲得中藥中難揮發(fā)和不揮發(fā)成分的譜圖。)由于

4、分離效率高，適用樣品范圍廣，分析成本低而得到廣泛的應用，在中藥指紋圖譜研究中已有不少報道&%，比如，十大功勞藥材&9和梔子藥材&8的)指紋圖譜等。然而，必須承認，中藥指紋圖譜的研究才剛剛起步由于指紋圖譜分析是一項極為復雜的系統(tǒng)工程，原料藥材和成藥的組成和療效又受許多因素的影響，故要將色譜或)指紋圖譜作為普適而有效的質量標準尚有很多必須解決的問題。原料藥材的質量穩(wěn)定性和投料物的選擇、用于不同藥材和制劑的指紋圖譜分析的技術確定和方法驗證、數(shù)據(jù)處理的規(guī)范和圖譜解析標準&、優(yōu)良實驗室規(guī)范（ILK）、優(yōu)良制造規(guī)范（IQK）和整個分析方法的自動化問題等等，均需要做全面而系統(tǒng)

5、的研究。" 有效成分的提取和測定雖然指紋圖譜肯定是建立中藥質量標準的一條途徑，但僅僅靠指紋圖譜恐怕還不能完全解決畢竟經(jīng)過祖輩幾千年的積累，又有現(xiàn)代中國幾十年!""#年9月T0->!""#色 譜!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&"的研究，我們在中藥有效成分的分離鑒定方面已經(jīng)獲得了豐富的知識，已經(jīng)可以準確分析和測定許多中藥的有效成分。我們認為，有效成分的定量分析與指紋圖譜的研究是中藥質量評價的兩個重要方面

6、，缺一不可。二者的有效結合，才是建立中藥質量標準的有效途徑。在中藥有效成分的提取和測定方面，色譜和!"技術一直扮演著主要的角色。從早期的以薄層色譜為主，到后來#!和$%&!的應用越來越普遍，再到近十年來!"的異軍突起，使得中藥有效成分的提取分離和測定技術日趨先進。目前，$%&!在中藥有效成分的分析方面發(fā)揮著不可替代的作用，(，而近年來快速發(fā)展的!"技術則是液相色譜的有力補充，因為!"有多種分離模式，切換方便且分析成本低，很適合于復雜樣品的分離分析。在基因測序、蛋白質分析和手性藥物分離方面，!"已經(jīng)顯示了強大的優(yōu)勢。在中藥分析中也

7、已經(jīng)有大量的文獻報道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 細 管 區(qū) 帶 電 泳（!*" ）!+、 膠 束 電 動 毛 細 管 色 譜（,"-!）.!/、微乳電動色譜（,""-!）/，/0非水毛細管電泳（12!"）/3、毛細管電色譜（!"!/4等，分析對象包括中草藥中的各類物質（包括酸性、堿性和中性的物質），如有機酸生物堿、黃酮及其甙類、香豆素類、氨基酸類、蛋白質類及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分離特征，還可以研究植物生長環(huán)境如空間失重條件對中藥質量的影響/5。研究結果表明，不同的模式可用于同一類有效成分的分析，但選擇性不

8、同/+；!"不僅是$%&!很好的補充，而且在很多方面優(yōu)于$%&!，比如，!"所采用的毛細管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中藥有效成分分析而言，!"在重復性和檢測靈敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影響電滲流的因素較多，人們對高電場作用下熔融石英毛細管內表面的物理化學性質還缺乏充分的認識，而大部分中藥組分極其復雜，某些組分可能與毛細管內壁發(fā)生相互作用，導致進樣分析過程中毛細管內表面性質的變化，從而造成電滲流的不重復。采用相對遷移值和疊加對比法可以在一定程度上克服重復性差的問題0(。另一方面，目前大部分!"

9、配備紫外吸收（67）或二極管陣列檢測器（828）進行柱上檢測，由于光程（毛細管內徑一般為3(!)("9）較短，進樣量有限（/(:&左右），故難以檢測樣品中的微量成分，特別是當這些微量成分是中藥的有效成分時，就難以準確判定樣品的質量。因此，深入研究熔融石英管內表面的物理化學性質，開發(fā)新的涂層技術、制備電滲流穩(wěn)定或精確可控的毛細管，開發(fā)成本低、靈敏度高且通用性好的檢測器，無疑是中現(xiàn)代化過程中!"研究的重要內容。目前改善!"檢測靈敏度主要有三個途徑。一是采用電噴霧譜（"<=,;）、激光誘導熒光（&<>）或電化學檢測等高靈敏度檢

10、測器。但前二者成本高，普及有困難，而且"<=,;對緩沖鹽的應用有較苛刻的要求，&<>則需要對很多無熒光特性的物質進行柱前或柱后的標記；電化學檢測器的通用性較差，電極的耐用性和重復性尚不能令人意。二是研究柱上濃縮或樣品堆積技術。對某些樣品成分，適當?shù)臐饪s可以使檢測靈敏度提高百倍到上千倍，這是很有意義的研究。三是進行分析前樣品預處理。采用包括超臨界流體萃取膜提取分離、超聲提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空氣爆破法、液泛法、大孔樹脂吸附分離以及雙水相萃取等高效提取工藝0)，0，比如高速逆流色譜對中藥有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印跡

11、聚合物（,<%）用于中藥有效成分的固相萃?。?%"）顯示了誘人的結果，徐筱杰教授的研究組05用;%"直接提取了銀杏葉中的黃酮。最近他們以抗表皮生長因子受體抑制劑（中藥有效成分）為模板分子合成了具有特殊選擇性的 ,<%，以此填充;%"小柱，從中藥中萃取了有關活性成分0+；進而他們此類 ,<%作親和色譜固定相，采用液相色譜=質譜在線聯(lián)用技術（&!=,;）選擇性分離和鑒定中藥中的抗癌成分0.。若將此類技術應用于!"分析的樣品處理，或者用于親和!"!以及!"!=,;對中藥有效成分的分離分析，必將進一步推動!"

12、;在中藥有效成分分析中的應用。! 活性成分的篩選過去的幾十年里，在分子水平上高通量篩選藥物先導化合物已經(jīng)成為新藥開發(fā)的主手段。中藥的藥理作用主要是基于分子水平上多成分、多靶點的組合作用，采用單一靶蛋白中藥中的活性成分難以取得滿意的結果。借鑒西藥的研究方法來篩選中藥活性成分也是中藥現(xiàn)代化研究的一個重要方面，而$%&!和!"在這方面無疑是極為重要的技術。日本學者曾以或動物為篩選模型，結合$%&!分離分析，對傳統(tǒng)中藥復方小柴胡湯的有效成分進行了篩選究3(；我國學者則提出了基于藥中多種活性成分的分離分析3)?？捎糜谥兴幍暮Y選3，固定化脂質體色譜也是一種有效的方法3/。近來，有

13、人又明確提出了生物功能化色譜的概念30，即將生物活性分子作為色譜固定相，或者鍵合到固定相上，使其具有某些生物的功能，在模擬生物條件下，對藥物分子進行分離，從而·/(+· 色 譜 第)卷" 有效成分的提取和測定雖然指紋圖譜肯定是建立中藥質量標準的一條途徑，但僅僅靠指紋圖譜恐怕完全解決問題。畢竟經(jīng)過祖輩幾千年的積累，又有現(xiàn)代中國幾十年!""#年9月T0->!""#色 譜!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&

14、amp;"的研究，我們在中藥有效成分的分離鑒定方面已經(jīng)獲得了豐富的知識已經(jīng)可以準確分析和測定許多中藥的有效成分。我們認為，有效成分的定量分析與指紋圖的研究是中藥質量評價的兩個重要方面，缺一不可。只有二者的有效結合，才是建立中藥質量的有效途徑。在中藥有效成分的提取和測定方面，色譜和!"技術一直扮演著主要的角色。從早期的以薄層色譜為主，到后來#!和$%&!的應用越來越普遍，再到近十年來!"的異軍突起，使得中藥有效成分的提取分離和測定技術日趨先進。目前，$%&!在中藥有效成分的分析方面發(fā)揮著不可替代的作用，(，而近年來快速發(fā)展的!"技術則是液相

15、色譜的有力補充，因為!"有多種分離模式，切換方便，且分析成本低，很適合于復雜樣品的分離分析。在基因測序、蛋白質分析和手性藥物分離方面，!"已經(jīng)顯示了強大的優(yōu)勢。在中藥分析中也已經(jīng)有大量的文獻報道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 細 管 區(qū) 帶 電 泳（!*" ）!+、 膠 束 電 動 毛 細 管 色 譜（,"-!）.!/、微乳電動色譜（,""-!）/，/0、非水毛細管電泳（12!"）/3、毛細管電色譜（!"!）/4等，分析對象包括中草藥中的各類物質（包括酸性、堿性和中性的物質），如有機酸、生物堿、黃酮及其甙類、香

16、豆素類、氨基酸類、蛋白質類及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分離特征，還可以研究植物生長環(huán)境如空間失重件對中藥質量的影響/5。研究結果表明，不同的模式可用于同一類有效成分的分析，但選擇性不同/+；!"不僅是$%&!很好的補充，而且在很多方面優(yōu)于$%&!，比如，!"所采用的毛細管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中藥有效成分分析而言，!"在重復性和檢測靈敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影響電滲流的因素較多，人們對高電場作用下熔融石英毛細管內表面的物理化學性質還缺乏充分的認識，而大部分中藥組分極其復雜某些組分

17、可能與毛細管內壁發(fā)生相互作用，導致進樣分析過程中毛細管內表面性質的變化，從而造成電滲流的不重復。采用相對遷移值和疊加對比法可以在一定程度上克服重復性差的問題0(。另一方面，目前大部分!"配備紫外吸收（67）或二極管陣列檢測器（828）進行柱上檢測，由于光程（毛細管內徑一般為3(!)("9）較短，進樣量有限（/(:&左右），故難以測樣品中的微量成分，特別是當這些微量成分是中藥的有效成分時，就難以準確判定樣品的質量。因此，深入研究熔融石英管內表面的物理化學性質，開發(fā)新的涂層技術、制備電滲流穩(wěn)定或精確可控的毛細管，開發(fā)成本低、靈敏度高且通用性好的檢測器，無疑是中藥現(xiàn)代化過

18、程中!"研究的重要內容。目前改善!"檢測靈敏度主要有三個途徑。一是采用電噴霧質譜（"<=,;）、激光誘導熒光（&<>）或電化學檢測等高靈敏度檢測器。但前二者成本高，普及有困難，而且"<=,;對緩沖鹽的應用有較苛刻的要求，&<>則需要對很多無熒光特性的物質進行柱前或柱后的標記；電化學檢測器的通用性較差，電極的耐用性和重復性尚不能令人意。二是研究柱上濃縮或樣品堆積技術。對某些樣品成分，適當?shù)臐饪s可以使檢測靈敏度提高上百到上千倍，這是很有意義的研究。三是進行分析前樣品預處理。采用包括超臨界流體萃取、膜提取分離

19、、超聲提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空氣爆破法、液泛法、大孔樹脂吸附分離以及雙水相萃取等高效提取工藝0)，0，比如高速逆流色譜對中藥有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印跡聚合物（,<%）用于中藥有效成分的固相萃?。?%"）顯示了誘人的結果，徐筱杰教授的研究組05用;%"直接提取了銀杏葉中的黃酮。最近他們以抗表皮生長因子受體抑制劑（中藥有效成分）為模板分子合成了具有特選擇性的 ,<%，以此填充;%"小柱，從中藥中萃取了有關活性成分0+；進而他們以此類 ,<%作親和色譜固定相，采用液相色譜=質譜在線聯(lián)用技術（&!=,;）選擇性分離和鑒定了中藥