蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能3ppt課件

1、(四四)第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 一一 、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)二、二、 蛋白質(zhì)分離和純化蛋白質(zhì)分離和純化三、三、 多肽鏈中氨基酸順序分析多肽鏈中氨基酸順序分析 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一兩性解離和等電點(diǎn)（一兩性解離和等電點(diǎn)及其分離純化及其分離純化 Pr Pr是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的主要取決于溶液的pHpH值。值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2OH-H+OH-H+pH=pIpHpIpIpI定義：定義： 在某一在某一pHpH值溶液中，值溶液中，PrPr酸性基團(tuán)和

2、堿性基團(tuán)酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng)?shù)慕怆x程度相當(dāng)PrPr分子所帶正負(fù)電荷相等，凈電分子所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零此時(shí)溶液的荷為零此時(shí)溶液的pHpH值稱為值稱為PrPr的的pIpI。PrPr分子顆粒大小分子顆粒大小1-100nm1-100nm之間之間, ,屬膠體顆粒范圍，屬膠體顆粒范圍，在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體。在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體。緣由：緣由：（二蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（二蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)表面形成水化層表面形成水化層表面同種電荷的斥力表面同種電荷的斥力1. 1. 蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)(denaturation)定義：在某些理化因素的作用下，定義：在某些理化

3、因素的作用下，PrPr嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞 （不包括肽鍵的斷裂），從而引起若干理化性質(zhì)和生（不包括肽鍵的斷裂），從而引起若干理化性質(zhì)和生 物學(xué)性質(zhì)改變的現(xiàn)象。物學(xué)性質(zhì)改變的現(xiàn)象。變性因素變性因素物理因素物理因素高溫、高壓高溫、高壓紫外線、紫外線、X射線、射線、電離輻射和超聲波等電離輻射和超聲波等化學(xué)因素化學(xué)因素強(qiáng)酸、強(qiáng)堿強(qiáng)酸、強(qiáng)堿有機(jī)溶劑、重金屬鹽有機(jī)溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等高濃度尿素、鹽酸胍等變性實(shí)質(zhì)：變性實(shí)質(zhì)：破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響分子組成、破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響分子組成、MWMW不變）。不變）。變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)旋光性、光吸

4、收改變等；旋光性、光吸收改變等；生物學(xué)活性喪失生物學(xué)活性喪失理化性質(zhì)改變理化性質(zhì)改變易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解溶解度溶解度，沉降率，沉降率，粘度粘度，擴(kuò)散速度擴(kuò)散速度，酶水解。酶水解。變性變性可逆變性：可逆變性：Pr變性后如將變性劑除去，該變性后如將變性劑除去，該P(yáng)r分子的天然構(gòu)象和生物學(xué)分子的天然構(gòu)象和生物學(xué) 活性還能恢復(fù)。活性還能恢復(fù)。不可逆變性：若變性條件強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)像變化大，理化性不可逆變性：若變性條件強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)像變化大，理化性 質(zhì)難以恢復(fù)。質(zhì)難以恢復(fù)。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。+-+-帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電

5、點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸酸酸堿堿堿堿脫水脫水脫水脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 （沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）堿堿酸酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）（五）、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法層析法層析法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過(guò)濾分子篩）凝膠過(guò)濾分子篩）親和層析親和層析。電學(xué)法電學(xué)法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法純度、純度、Mw和和pI測(cè)定測(cè)定層析法：凝膠過(guò)濾層析法：凝膠過(guò)濾;高效液相色譜法高效液相色譜法電泳法：電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚焦電、梯度凝膠電泳、等電

6、聚焦電泳等泳等免疫化學(xué)法：專一的沉淀線免疫化學(xué)法：專一的沉淀線SDS PAGE電泳法：測(cè)定亞基數(shù)電泳法：測(cè)定亞基數(shù)超速離心：成分均一超速離心：成分均一其它：如其它：如, 結(jié)晶法結(jié)晶法叫分段鹽析法叫分段鹽析法 等電聚膠電泳等電聚膠電泳 (isoelectric focusing gel IEF) SDS-PAGE separates proteins by MW帶正電荷多帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多帶負(fù)電荷多蛋白流過(guò)層析蛋白流過(guò)層析柱柱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂工作示意圖陽(yáng)離子交換樹(shù)脂工作示意圖Cation-exchangecolumnColumnChromatography瓊脂瓊脂 糖糖凝

7、膠凝膠連接臂連接臂Affinitychromatography定義：利用半透膜把大小分子分開(kāi)定義：利用半透膜把大小分子分開(kāi) 的方法。的方法。運(yùn)用：運(yùn)用：1.1.腹膜透析和人工腎腹膜透析和人工腎 ； 2. 2.反透析反透析 ； 3. 3. 超濾利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小超濾利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜分子雜 質(zhì)通過(guò)超濾膜除去，質(zhì)通過(guò)超濾膜除去，PrPr留在膜上而稱之。留在膜上而稱之。 透析工作圖透析工作圖半透膜原理半透膜原理 超速離心超速離心 步驟：步驟： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加樣加樣 C.離心離心 D.收集樣品收集樣品5. 5.測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰測(cè)定水解液中的氨

8、量，計(jì)算酰胺的含量。胺的含量。倒推法倒推法順序測(cè)定法順序測(cè)定法倒推法：倒推法：組織組織Pr、DNAmRNAcDNA測(cè)定并識(shí)讀測(cè)定并識(shí)讀cDNA序列序列分析分析AA組成，推知組成，推知Pr一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)純）蛋白質(zhì)純） 測(cè)定分子量，估計(jì)AA殘基數(shù)除120）氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定測(cè)定AA數(shù)量、種類和比例數(shù)量、種類和比例肽鏈拆開(kāi)肽鏈拆開(kāi)次級(jí)鍵：用次級(jí)鍵：用8mol/L脲脲 或或6mol/L 鹽酸胍鹽酸胍二硫鍵：過(guò)甲酸；巰基乙醇；二硫鍵：過(guò)甲酸；巰基乙醇；1，4二硫代蘇糖醇二硫代蘇糖醇肽鏈末端分析肽鏈末端分析N端：二硝基氟苯；丹磺酰氯法端：二硝基氟苯；丹磺酰氯法C端

9、：肼解法；羧肽酶法端：肼解法；羧肽酶法肽鏈選擇性裂解肽鏈選擇性裂解化學(xué)法：溴化氰裂解；羥胺法化學(xué)法：溴化氰裂解；羥胺法酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋 白酶、木瓜蛋白酶等白酶、木瓜蛋白酶等肽段分離肽段分離凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾離子交換層析離子交換層析氨基酸順序分析：氨基酸順序分析：Edman法異硫氰酸苯降解法）；酶法異硫氰酸苯降解法）；酶解法解法多多肽肽鏈鏈中中氨氨基基酸酸序序列列分分析析的的主主要要步步驟驟純度、純度、Mw和和pI測(cè)定測(cè)定層析法：凝膠過(guò)濾層析法：凝膠過(guò)濾;高效液相色譜法高效液相色譜法電泳法：電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚、梯度凝膠電泳、等電聚

10、焦電泳等焦電泳等免疫化學(xué)法：專一的沉淀線免疫化學(xué)法：專一的沉淀線SDS PAGE電泳法：測(cè)定亞基數(shù)電泳法：測(cè)定亞基數(shù)超速離心：成分均一超速離心：成分均一其它：如其它：如, 結(jié)晶法結(jié)晶法一、名詞解釋一、名詞解釋氨基酸殘基氨基酸殘基 亞基亞基 變構(gòu)效應(yīng)變構(gòu)效應(yīng) 協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng) PrPr的兩性電離的兩性電離 PrPr的的pI pI 鹽析鹽析 蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性 超二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域分子伴侶分子伴侶復(fù)習(xí)思考題復(fù)習(xí)思考題1. 1.為什么說(shuō)：為什么說(shuō)：“蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)”？2. 2.簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)螺旋和螺旋和折疊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。折疊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。3. 3.什么

11、是什么是PrPr的一、二、三和四級(jí)結(jié)構(gòu)，分別指出的一、二、三和四級(jí)結(jié)構(gòu)，分別指出 維持它們結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵。維持它們結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵。4. 4.舉例說(shuō)明舉例說(shuō)明PrPr結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。5. 5.簡(jiǎn)述簡(jiǎn)述PrPr變性、沉淀和凝固的定義及彼此之間的關(guān)系。變性、沉淀和凝固的定義及彼此之間的關(guān)系。6.Pr6.Pr定量測(cè)定的方法主要有哪些？定量測(cè)定的方法主要有哪些？二、問(wèn)答題二、問(wèn)答題1 1 天然蛋白質(zhì)中不存在的氨基酸是天然蛋白質(zhì)中不存在的氨基酸是 A A蛋氨酸蛋氨酸B B胱氨酸胱氨酸C C羥脯氨酸羥脯氨酸D D同型半胱氨酸同型半胱氨酸E E精氨酸精氨酸2 2下列哪種氨基酸在肽鏈中形成拐角下

12、列哪種氨基酸在肽鏈中形成拐角A A纈氨酸纈氨酸B B酪氨酸酪氨酸C C脯氨酸脯氨酸D D蘇氨酸蘇氨酸E E色氨酸色氨酸三、選擇題三、選擇題4. 4. 有關(guān)血紅蛋白有關(guān)血紅蛋白(Hb)(Hb)和肌紅蛋白和肌紅蛋白(Mb)(Mb)的敘述不正確的是的敘述不正確的是 A.A.都可以和氧結(jié)合都可以和氧結(jié)合 B.HbB.Hb和和MbMb都含鐵都含鐵 C.C.都是含輔基的結(jié)合蛋白都是含輔基的結(jié)合蛋白 D.D.都具有四級(jí)結(jié)構(gòu)形式都具有四級(jí)結(jié)構(gòu)形式 E.E.都屬于色蛋白類都屬于色蛋白類5 5 有一血清清蛋白有一血清清蛋白(pI(pI6 685)85)的混合物，在哪種條件下電泳分的混合物，在哪種條件下電泳分 離效

13、果最好離效果最好? ? A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 E.pH3.5 E.pH3.5 3 3 下列有關(guān)蛋白質(zhì)下列有關(guān)蛋白質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的敘述正確的是片層結(jié)構(gòu)的敘述正確的是 A. A.主鏈骨架呈鋸齒狀主鏈骨架呈鋸齒狀 B. B.兩個(gè)相鄰的肽平面呈折紙狀兩個(gè)相鄰的肽平面呈折紙狀 C. C.片層結(jié)構(gòu)是一種較伸展的肽鏈結(jié)構(gòu)片層結(jié)構(gòu)是一種較伸展的肽鏈結(jié)構(gòu) D. D.若干矩齒狀肽鏈骨架平行或反平行排列，鏈間靠氫鍵維系若干矩齒狀肽鏈骨架平行或反平行排列，鏈間靠氫鍵維系 E. E.以上都正確以上都正確7.7.蛋白質(zhì)分子引起蛋白質(zhì)分子引起280nm280nm光吸收的最主要成分是光吸收的最主要成分是 A.A.肽鍵肽鍵 B.B.半胱氨酸的半胱氨酸的-SH-SH基基 C.C.苯丙氨酸的苯環(huán)苯丙氨酸的苯環(huán) D.D.色氨酸的吲哚環(huán)色氨酸的吲哚環(huán) E.E.組氨酸的咪唑環(huán)組氨酸的咪唑環(huán)6. 經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定，一血清標(biāo)本的含氮量為經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定，一血清標(biāo)本的含氮量為10g/L ，那么，蛋白，那么，蛋白質(zhì)的濃度是多少？質(zhì)的濃度是多少？ A. 52.5g/L B. 57.5g/L C. 62.5g/L D. 67.5g/