4 生物大分子相互作用分析技術(基礎醫(yī)學與醫(yī)學實驗技術)

1、第六章第六章 生物大分子相互作用生物大分子相互作用 分析技術分析技術劉劉 蕓蕓 第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義生物大分子相互作用分析的意義 第二節(jié)第二節(jié) 常見的生物大分子相互作用分析方法常見的生物大分子相互作用分析方法 第三節(jié)第三節(jié) 生物大分子相互作用分析新進展生物大分子相互作用分析新進展（FRET、SPR）l真核生物細胞真核生物細胞 l原核生物細胞原核生物細胞 細胞結構細胞結構 cell原核生物細胞結構原核生物細胞結構肽聚糖肽聚糖被膜被膜質膜質膜動物細胞動物細胞植物細胞植物細胞細胞壁、細胞膜、細胞質和細胞核細胞壁、細胞膜、細胞質和細胞核真核生物細胞結構真核生物細胞結構細胞中的大分

2、子細胞中的大分子 Macromolecules in CellsThe approximate composition of a bacterial cell.分子水平DNAsequenceProteins Structure Function?All Cell 第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義生物大分子相互作用分析的意義DNAPrimary transcriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNA degradationcont

3、roltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表達的調控層次基因表達的調控層次Protein complexSignaling net work生命機制生命機制蛋白質組學的分類蛋白質組學的分類? 表達蛋白質組學表達蛋白質組學Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable? 結構基因組學結構基因組學Goal is to map out the 3-D structure of proteins and

4、protein complexes? 功能蛋白質組學功能蛋白質組學To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.l蛋白質結構和序列特點蛋白質結構和序列特點l蛋白質進化過程和保守序列蛋白質進化過程和保守序列l(wèi)蛋白質表達譜蛋白質表達譜l蛋白在細胞內的定位及其相關聯(lián)的細胞器或蛋白在細胞內的定位及其相關聯(lián)的細胞器或結構結構l

5、蛋白質翻譯后修飾情況蛋白質翻譯后修飾情況l了解與其相關聯(lián)的其他細胞蛋白質了解與其相關聯(lián)的其他細胞蛋白質蛋白質信息的不同層次蛋白質信息的不同層次v 蛋白質同源二聚體蛋白質同源二聚體(homodimer)v 蛋白質異源二聚體蛋白質異源二聚體(heterodimer)v 蛋白質多聚體蛋白質多聚體(polymer)v 蛋白質蛋白質-DNA復合物復合物(protein-DNA complex)v 蛋白質-脂質復合物(protein-lipid complex)v 蛋白質-RNA復合物(protein-RNA complex)v DNA-DNA復合物(DNA-DNA complex)v 生物大分子復合物的

6、類型生物大分子復合物的類型第二節(jié)第二節(jié) 生物大分子相互作用分析技術生物大分子相互作用分析技術 1. 研究思路研究思路2. 分類分類3. 技術介紹技術介紹生物大分子相互作用分析研究思路生物大分子相互作用分析研究思路鑒定與目標分子相鑒定與目標分子相互作用的所有可能互作用的所有可能大分子大分子詳細描述其生物功能詳細描述其生物功能及相互作用對其功能及相互作用對其功能的影響的影響鑒定出相互作用且在生理鑒定出相互作用且在生理狀態(tài)下得到了驗證和合理狀態(tài)下得到了驗證和合理的解釋的解釋v GST 融合蛋白技術融合蛋白技術(GST pull-down)v 免疫共沉淀免疫共沉淀(Immunoprecipitatio

7、n, Co-IP )v 串聯(lián)親和純化串聯(lián)親和純化(Tandem Affinity Purification，TAP)v 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid)v 噬菌體展示噬菌體展示(Phage display)v 細胞內蛋白質共定位細胞內蛋白質共定位(Co-localization)v 熒光共振能量轉移熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)v 表面等離子共振表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)v 生物大分子相互作用分析技術生物大分子相互作用分析技術1.GST融

8、合蛋白技術融合蛋白技術 （GST pull-down assay）基于重組蛋白表達純化技術的體外分析系統(tǒng)基本原理：基本原理：是將靶蛋白是將靶蛋白-GST融合蛋融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為作為與目的蛋白親和的支撐物與目的蛋白親和的支撐物,充當一種充當一種“誘誘餌蛋白餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲可從中捕獲與之相互作用的與之相互作用的“捕獲蛋白捕獲蛋白”(目的蛋白目的蛋白),洗脫結合物后通過洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白相應的目的

9、蛋白,“誘餌蛋白誘餌蛋白”和和“捕獲蛋捕獲蛋白白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。獲得。 GST pull-down assayPurification of proteinGlutathione columnGlutathione beadGST fusion proteinTags Pull-Down 方法的組成方法的組成RtagbaitpreyResinBaitPreyTags （GST, His, Flag, HA, MBP）RPull-down experimentRWashRR

10、Add preyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAdd preyWashRRElutionAnalysis S CSDS-PAGE gel實驗設計思路實驗設計思路GSTXY谷胱甘肽谷胱甘肽-瓊脂糖微珠瓊脂糖微珠細胞裂解物細胞裂解物 tube4下孵育下孵育2h2h GST融合蛋白融合蛋白GSTXY+實驗流程實驗流程GST pull-down 應用應用l鑒定未知相互作用的蛋白l鑒定預測的或已知的相互作用GST pull down驗證兩種已知蛋白質驗證兩種已知蛋白質（X-Y）的相互作用）的相互作用舉舉 例例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-G

11、FP105kDAnti-GFPX-GFP + + +GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP2. 免疫共沉淀免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ）非常有效地用于鑒定細胞內生理上的蛋白質相互作用的分析技術 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：）：是以是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整細質相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。胞內生理性相互作用的有效方法。 基本原理基本原理：當細胞

12、在當細胞在非變性條件下非變性條件下被裂解時，完整被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀的抗體免疫沉淀X，那么與，那么與X在在體內結合的蛋白質體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。也能沉淀下來。GagaroseGagaroseXYGagarose實驗設計思路實驗設計思路實驗流程實驗流程SDS-PAGEProtein A/GSepharose誘餌誘餌蛋白質蛋白質抗體抗體離心離心誘餌誘餌蛋白質蛋白質Protein A/GSepharose離心離心傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法交聯(lián)方法交聯(lián)方法基礎：

13、基礎：細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內許多蛋細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內許多蛋白質之間的結合保持下來。白質之間的結合保持下來。要求要求：在一系列操作過程中保持蛋白質復合體不變在一系列操作過程中保持蛋白質復合體不變缺點缺點：可能檢測不到細胞內處于動態(tài)平衡中的低親和與可能檢測不到細胞內處于動態(tài)平衡中的低親和與瞬間的相互作用瞬間的相互作用,存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大量的細胞量的細胞局限：局限：僅應用于從細胞中溶解出來仍存在于生理復合物僅應用于從細胞中溶解出來仍存在于生理復合物中的蛋白質中的蛋白質Co-IP 應用應用l鑒定已知蛋白質相互作用的檢測l

14、鑒定新蛋白質間的相互作用免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質的免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質的相互作用相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP: HA control IgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput舉 例3.串聯(lián)親和純化串聯(lián)親和純化（Tandem Affinity Purification，TAP）a. One-step affinity purificationb. Two-step affinity purification (tandem affinity purification)Affinity purification (immunopurific

15、ation)融合了標準生化純化和免疫共沉淀策略的極為有效的快速純化蛋白質復合物的方法串聯(lián)親和純化技術的優(yōu)勢串聯(lián)親和純化技術的優(yōu)勢C與傳統(tǒng)的生化純化方法相比與傳統(tǒng)的生化純化方法相比C與免疫共沉淀方法相比與免疫共沉淀方法相比使用恒定的標簽和標準純化條件避免了每次都要設計新純化使用恒定的標簽和標準純化條件避免了每次都要設計新純化方案的問題方案的問題多步驟純化降低了細胞高豐度蛋白質以及免疫球蛋白的背景多步驟純化降低了細胞高豐度蛋白質以及免疫球蛋白的背景污染污染雙親和標簽：雙親和標簽：l ProAProA（葡萄球菌蛋白（葡萄球菌蛋白A A 的兩個免疫球蛋白的兩個免疫球蛋白IgGIgG結結合單位）合單位）

16、l CBPCBP（鈣調蛋白結合肽）（鈣調蛋白結合肽）實驗設計思路實驗設計思路實驗流程實驗流程鈣調素鈣調素結合肽結合肽TEV酶切酶切位點位點在在Ca2+ 離子下結合離子下結合TEV 酶切酶切用用EGTA 洗脫洗脫靶蛋白結合于靶蛋白結合于IgG珠子珠子充分洗滌后，在充分洗滌后，在TEV蛋白酶作蛋白酶作用下洗脫結合物用下洗脫結合物鈣離子存在下，將首次洗脫物鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質結合于鈣調蛋白包中的蛋白質結合于鈣調蛋白包被的珠子上被的珠子上充分洗滌后，加入充分洗滌后，加入EGTA洗洗脫結合物脫結合物4. 酵母雙雜交酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）基于在轉錄

17、水平上的直接在酵母細胞內檢測蛋白質之間相互作用的遺傳學方法基本原理：基本原理： 基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識?；趯φ婧松镎{控轉錄起始過程的認識。 前者可識別前者可識別DNA上的特異序列，上的特異序列， 并使轉錄激活結構域定位于所調并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游，節(jié)的基因的上游， 轉錄激活結構轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作域可同轉錄復合體的其他成分作用，用， 啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。二個結構域不但可在其連接區(qū)適二個結構域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，當部位打開， 仍具有各自的功能。仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發(fā)揮轉而且不同

18、兩結構域可重建發(fā)揮轉錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。表達探測蛋白蛋白的相互作用。 典型的真核生長轉錄因子，典型的真核生長轉錄因子， 如如GAL4都含有二個不同的結構域：都含有二個不同的結構域：DNA結合結構域（結合結構域（DNA-binding domain，BD）和轉錄激活結構域）和轉錄激活結構域（transcription-activating domain，AD）。）。酵母雙雜交酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）三個基本組成部分三個基本組成部分1. 表

19、達誘餌蛋白的載體表達誘餌蛋白的載體，誘餌即我誘餌即我們感興趣的蛋白，它和們感興趣的蛋白，它和DNA結合結構結合結構域融合。域融合。2. 表達靶蛋白的載體表達靶蛋白的載體，靶蛋白可以是靶蛋白可以是一個已知的蛋白，也可以是一個已知的蛋白，也可以是cDNA或或基因組文庫編碼的蛋白。靶蛋白和轉基因組文庫編碼的蛋白。靶蛋白和轉錄激活結構域融合。錄激活結構域融合。3. 一個或多個報告基因一個或多個報告基因（如控制氨基如控制氨基酸合成的基因、大腸桿菌的酸合成的基因、大腸桿菌的lacZ基因基因等），位于等），位于DNA結合結構域識別的調結合結構域識別的調控區(qū)的下游?？貐^(qū)的下游。 ADDBDgene+repor

20、terMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD實驗設計思路實驗設計思路Target:未知蛋白或未知蛋白或將將研究對象研究對象+ DNA binding domainBait:已知蛋白已知蛋白+ activation domainTarget 與與Bait可互換可互換轉入同一個酵母菌中轉入同一個酵母菌中Construct target plasmid and bait plasmidTransformationScreeningDNA extractionDNA sequencingYeast Two-Hybrid Assaynucleushis- leu- tr

21、p-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ優(yōu)勢：優(yōu)勢：酵母雙雜交方法的優(yōu)勢及缺陷酵母雙雜交方法的優(yōu)勢及缺陷C 采用酵母菌株采用酵母菌株C 敏感度高敏感度高C 蛋白折疊蛋白折疊C 易于篩選易于篩選C 應用范圍廣應用范圍廣缺陷：缺陷：I 核內作用核內作用I 假陽性假陽性I 假陰性假陰性I 轉化率轉化率酵母雙雜交方法的應用酵母雙雜交方法的應用l高靈敏度地檢測蛋白蛋白的相互作用 l確定蛋白相互作用的結構域或重要活性位點 l尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白 l尋找具有藥物治療作用的小分子肽 l尋找控制蛋白相互作用的化合物 l蛋白

22、相互作用圖譜的繪制舉舉 例例酵母雙雜交前準備工作酵母雙雜交前準備工作雙酶切驗證雙酶切驗證21kb5kb3.5kb2kb1.5kb M 1 M:marker1:pGBKT7-BD-X構建誘餌質粒構建誘餌質粒誘餌蛋白的表達誘餌蛋白的表達X-BDGal4-BD檢測誘餌蛋白是否有毒性檢測誘餌蛋白是否有毒性1 2 3Western blot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生長曲線酵母生長曲線1.未轉化酵母未轉化酵母2.BD-酵母酵母3.X-BD-酵母酵母酵母雙雜交結果酵母雙雜交結果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）舉舉

23、例例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD X-半乳糖苷酶藍白斑顯色分析半乳糖苷酶藍白斑顯色分析舉舉 例例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD酵母雙雜交測序結果酵母雙雜交測序結果酵母雙雜交得到的陽性克隆子質粒經(jīng)過酵母雙雜交得到的陽性克隆子質粒經(jīng)過DNA測序，由測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索檢索cDNA編碼的蛋白質編碼的蛋白質舉舉 例例5.噬菌體展示技術噬菌體展示技術（Phage display）基于將某個蛋白與其遺傳信息之間直接聯(lián)系的篩選

24、方法 噬菌體展示技術是將外源蛋白噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的或多肽的DNA序列插入到噬菌體外序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。裝而展示到噬菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已開發(fā)出了單鏈到目前為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、噬菌體展噬菌體展示系統(tǒng)、示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示系統(tǒng)。 特特 點點 該技術的主要特點是

25、將特定分子的該技術的主要特點是將特定分子的基因型基因型和和表型表型統(tǒng)一統(tǒng)一在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在噬菌體核心在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結構基因。另外，這中則含有該蛋白的結構基因。另外，這項技術把基因表達產(chǎn)物與親和篩選結合起來，可以利用適項技術把基因表達產(chǎn)物與親和篩選結合起來，可以利用適當?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。當?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。lUsed for cloning foreign genes among other applicationslProteins and peptides

26、 are fused to the Capsid (surface) of the phagelThe combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein實驗設計思路實驗設計思路phageslFilamentous phages M13FdF1lOthersT4Filamentous phageslInfect many gram-negative bacterialCircular single stranded DNA genomelAbout 6.4kb.p.lLong, flexible tube stru

27、cturelabout 1m long and 6.5nm in diameterlReproduced and secreted from infected bacteria without cell killing or lysis (lysogenic phage)(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus.(e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g

28、) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.M13 噬菌體顆粒結構噬菌體顆粒結構M13噬菌體的生活史噬菌體的生活史其裂解周期為：其裂解周期為：1)吸附吸附(adsorption) 2)侵入侵入(entory)3)復制（生物合成復制（生物合成biosynthesis）4)成熟成熟(maturation) 5)裝配裝配(assembly)6)釋放釋放(release)絲狀噬菌體的基因及蛋白結構絲狀噬菌體的基因及蛋白結構http:/www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=s

29、ci_arttext pIII (406aa, 58copies) pVIII (50aa, 2700 copies) pVI (112aa, 58copies)載體的插入位點載體的插入位點 pIII 和和pVIII 噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)pIII系統(tǒng)pVIII系統(tǒng)拷貝數(shù)拷貝數(shù)少少多多多肽片段大小多肽片段大小大大1010個氨基酸個氨基酸親和力親和力高高低低適用范圍適用范圍常用于展示由常用于展示由cDNAcDNA和和基因組序列編碼的多基因組序列編碼的多肽，范圍較廣肽，范圍較廣展示小肽，范圍較窄展示小肽，范圍較窄測序分析插入序列將噬菌體文庫鋪在固定的靶蛋白上洗脫未結合的噬菌體加入大腸桿菌，擴

30、增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫鋪盤分離單個克隆34輪篩選驗證實驗：結合實驗實驗流程實驗流程 優(yōu)點：優(yōu)點： A. 高通量的淘選：高通量的淘選：將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數(shù)量可達庫（噬菌體的數(shù)量可達1011 PFU），利用抗原），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結合的噬抗體的特異性親和力將與抗體結合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異菌體吸附在固相載體上，不能結合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結合的噬菌體洗脫下來，如此反復數(shù)輪擴增、淘選，即可將有

31、用的基因從多達百萬以上結合的噬菌體洗脫下來，如此反復數(shù)輪擴增、淘選，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。的噬菌體克隆中分離出來。B. 可用于模擬表位的篩選可用于模擬表位的篩選 ：利用噬菌體展示技術得到模擬表位的報道較多模利用噬菌體展示技術得到模擬表位的報道較多模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應，例如利用乙肝病毒的模擬表位免擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。疫小鼠可誘導產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。C. 易于純化易于純化 重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設備，重組噬菌體的純化步

32、驟簡單、不要求昂貴的試劑與設備，在一般的實驗室條件下就可以完成。在一般的實驗室條件下就可以完成。 缺點：缺點： 首先，目前所建的肽庫容量只能達到首先，目前所建的肽庫容量只能達到109，要想構建大片段的肽庫，要想構建大片段的肽庫很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過強，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。水性過強，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。 噬菌體展示系統(tǒng)的應用及優(yōu)缺點噬菌體展示系統(tǒng)的應用及優(yōu)缺點6、細胞內蛋白質共定位、細胞內蛋白質共定位（cellular co-locali

33、zation）基于細胞內綠色蛋白示蹤技術的蛋白質間相互的研究方法綠色熒光綠色熒光羅丹明染色羅丹明染色重重 疊疊相相 差差舉舉 例例細胞內蛋白質共定位研究兩種已知細胞內蛋白質共定位研究兩種已知蛋白質時空表達關系蛋白質時空表達關系舉舉 例例第三節(jié)第三節(jié) 生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析新技術新技術 1、熒光共振能量轉移技術、熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）能夠對于細胞中的蛋白質間相互作用或對作用進行實時原位分析的檢測方法供體熒光素 受體熒光素FRET現(xiàn)象現(xiàn)象 Binding NO BindingFRET: T

34、he Size 當一個熒光分子當一個熒光分子(又稱為又稱為供體分子供體分子)的熒光光譜與另的熒光光譜與另一個熒光分子一個熒光分子(又稱為又稱為受體受體分子分子)的激發(fā)光譜相重疊時的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光受體分子發(fā)出熒光，同時供同時供體熒光分子自身的熒光強度體熒光分子自身的熒光強度衰減衰減。FRET 程度與供、受程度與供、受體分子的空間距離緊密相關體分子的空間距離緊密相關，一般為一般為710 nm 時即可發(fā)時即可發(fā)生生FRET；隨著距離延長隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱呈顯著減弱.實驗設計實驗設計InteractionXCFPYYFP

35、UV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissionDonorAcceptorFRET的能量供體和受體的能量供體和受體滿足條件：滿足條件： 供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開；供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開； 供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊；供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊； 供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 綠綠 色色 熒熒 光光 蛋蛋 白白CFP (青色熒光蛋白青色熒光蛋白)(第第6

36、6位位TyrTrp)(第第203位位ThrTyr)YFP (黃色熒光蛋白黃色熒光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP (513nm / 527nm)FRET的能量供體和受體的能量供體和受體 均相檢測（無分離和洗滌步驟）均相檢測（無分離和洗滌步驟） 實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化FRET技術的優(yōu)勢技術的優(yōu)勢Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET應用的類型應用的類型FRET應用范圍應用范圍 酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展

37、示系統(tǒng)所篩選克隆的復證酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復證 蛋白質蛋白質核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白酶、磷酸激酶 鈣流檢測、離子通道研究鈣流檢測、離子通道研究 蛋白質的結構研究蛋白質的結構研究FRET應用的局限性應用的局限性 信噪比經(jīng)常不佳，通常為信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1 -背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號 檢測儀器的靈敏度、分辨率以及計算機影像采集和檢測儀器的靈敏度、分辨率以及計算機影像采集和分析軟件的能力分析軟件的能力2、表面等離子共振技術、表面等離子共振技術（surface plasmon resonan

38、ce，SPR）適合于多種類型分子并且無需借助標記物可以實現(xiàn)對復合物直接實時測定的方法 SPRimagerII 基本原理：基本原理：基于表面等離子共振（基于表面等離子共振（SPR）技術）技術來實時跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標記來實時跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標記物。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，物。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面的分子結合、器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面的分子結合、解離整個過程的變化。解離整個過程的變化。

39、SPR 現(xiàn)象現(xiàn)象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等離子共振（表面等離子共振（SPR）是一種物理現(xiàn)象，當入射光以臨界角入射到兩種不同折是一種物理現(xiàn)象，當入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時，可引起金屬自由電子的共振，由于電射率的介質界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時，可引起金屬自由電子的共振，由于電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內大大減弱。其中，使反射光在一定角度內完子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內大大減弱。其中，使反射光在一定角度內完全消失的入射角稱為全消失的入射角稱為SPR角。角。SPR

40、隨表面折射率的變化而變化，而隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結合折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質量成正比。在金屬表面的生物分子質量成正比。因此可以通過獲取生物反應過程中因此可以通過獲取生物反應過程中SPR角的動態(tài)變化，角的動態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號。得到生物分子之間相互作用的特異性信號。 SPR 角度角度掃描曲線掃描曲線SPR angle傳統(tǒng)檢測原理傳統(tǒng)檢測原理SPR angle shift as basis of measurementSPR imaging 檢測原理檢測原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflec

41、tivity change as basis of measurementSPRimager 系統(tǒng)系統(tǒng)Rotating Stage流動相流動相（含待分析物）（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol light棱鏡棱鏡分子探針陣列分子探針陣列GWCs “SPR Imaging” 技術技術Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes: Image + ChartVa