肝癌靶向性AGAP表達載體構建及生物信息學分析

1、肝癌靶向性AGAP表達載體構建及生物信息學分析 作者：金思思，吳金明，黃智銘，吳建勝，申蘇建【摘要】 目的?：構建肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)特異性鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(analgesic-antitumor peptide，AGAP)基因真核表達載體，利用計算機輔助分析和預測所表達蛋白質的理化和結構特征，為探索生物毒素靶向抗肝癌作用奠定基礎。方法：提取東亞鉗蝎總RNA，用RT-PCR法擴增出AGAP基因，與載體pGL3/AFP連接構建重組質粒，酶切及測序鑒定，并利用蛋白質分析軟件對其表達的蛋白二級結構水平及一些生物學特性進行預測，并轉染HepG2細胞檢測其是否

2、表達。結果：重組質粒所表達的目的多肽經軟件分析，發(fā)現(xiàn)在二級結構上沒有變化，親水性、抗原性等生物學活性也未受影響，轉染HepG2細胞后能成功表達。結論：人AFP基因順式作用元件調控AGAP真核表達載體構建成功。 【關鍵詞】 甲胎蛋白;鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽;真核表達載體;肝腫瘤Abstract: ? Objective: To construct a gene-modified hepatocellular carcinoma?(HCC)?specific AGAP expression vector regulated by the cis-acting element of AFP. The phys

3、icochemical property and structural characteristics of the protein were analyzed and predicted by computer-aided analysis to establish a basis for exploring biotoxin thepapy for tumor. Method:?The AGAP DNA fragment was amplified through RT-PCR from the total RNA of Chinese Buthus Martensii Karsch. I

4、t was then cloned into the plasmid pGL3/AFP. The recombinant plasmid pAFP-AGAP was identified by restriction endonucleases and nucleotide sequence. The protein analysis software were utilized to predict the flexibility，hydrophilicity，and antigenicity of the new AGAP protein. Then the expression leve

5、ls of AGAP mRNA were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction?(RT-PCR)?after the recombinant plasmid being transfected into HepG2 cell line. Results:?Through the analysis of the software，?it could be found that the secondary structure of the new AGAP didnt almost changed and remai

6、n their biologic activity. The recombinant plasmid was successfully to express AGAP mRNA in HepG2 cell line. Conclusion:?The recombinant vector is constructed successfully.Key words: ?alpha fetoprotein;analgesic-antitumor peptide;eukaryotic expression vector; hepatocellular carcinoma肝細胞癌(hepatocellu

7、lar carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，是我國癌癥患者病死率最高的疾病之一。手術、放化療及介入等常規(guī)治療效果均不理想，不能從根本上改善患者的預后。目前，利用基因工程的手段，實現(xiàn)AFP轉錄調控序列驅動目的基因表達，對肝癌進行基因治療，是肝癌治療的熱點1。另外，蝎毒是一種毒性僅次于蛇毒的生物毒素，早在宋代全蝎就被用于治療驚厥、癲癇及腫瘤等疾病。很多人試圖從蝎毒中提取有抗腫瘤活性的組分，開發(fā)有效的、相對毒副作用較小的新藥。近年來，東亞鉗蝎毒(Buthus martensii Karsch)的藥用研究是我國生物毒素方面研究和開發(fā)的熱點之一。東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(Analgesi

8、c-antitumor peptide，AGAP)就是從東亞鉗蝎毒中分離出的一種有效的抗腫瘤成分，對多種腫瘤細胞有細胞毒作用，并對動物移植癌有抑制作用2-3。本實驗利用基因工程手段，構建重組質粒，實現(xiàn)AGAP細胞內直接表達，省去了蝎毒分離、純化等繁瑣步驟，為進一步研究其在肝癌基因治療中的作用奠定了基礎。1?材料和方法1.1?材料?攜帶有效AFP啟動子和增強子組合的質粒pGL3/AFP由Cheng Qian(Fundacin para la Investigacin Mdica Aplicada)構建饋贈。菌株DH5和人肝癌細胞(HepG2)由本室凍存。RNA提取試劑(RNAiso Reagen

9、t)、逆轉錄試劑盒(BCa BESTTM RNA PCR Kit Ver 1.1)購自大連寶生物公司，各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，質粒提取試劑盒(EZ Spin Col-umn Plasmid DNA Minipreps Kit)購自BBI公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，胰酶購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。1.2?引物設計?根據GeneBank中AGAP(AF464898)能表達66個成熟肽的基因序列及pGL

10、3/AFP序列進行引物設計。AGAP基因上游引物順序為：5- CATGCC ATGGCCGTACGCGATGGTTATATTGCCG -3，引入了Nco I酶切位點，下游引物順序為：5- TGCTCTAGAGACCG CCATTGCATTTTCCTG -3，引入了Xba?I酶切位點，酶切位點已含起始密碼和終止密碼。1.3?AGAP基因克隆?取新鮮的蝎尾，抽提RNA，按試劑盒步驟操作。利用RT試劑盒反轉錄出cDNA第1鏈，引物采用Oligo dT，條件為：65 1 min、30 5 min、65 20 min、98 5 min、5 5 min。采用高保真Taq酶進行隨后的PCR反應。PCR條件為

11、：94 預變性5 min，94 30 s、54 30 s、72 1 min，28個循環(huán)，末次72 延伸5 min。取PCR產物電泳，后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收待用。1.4?pAFP-AGAP真核表達載體構建及鑒定?取質粒pGL3/AFP用Nco?I和Xba?I雙酶切，將所需載體片段4?188 bp經電泳分離出并回收。膠回收的AGAP基因片段經Nco?I和Xba?I雙酶切，獲目的基因201 bp與所需載體片段4?188 bp按3:1的比例混合，加入T4 DNA連接酶進行連接反應，16 過夜。將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5，擴增后質粒提取試劑盒提取。新構建重組真核表達載體pAFP-AGAP(見

12、圖1)酶切鑒定并測序。雙向測序由華大基因完成。1.5?生物信息學分析?DNA測序驗證重組質粒pAFP-AGAP的方向性和正確性，雙向序列測定由華大基因公司完成，測序結果使用Gene bank Blast進行比對;采用Vector NTI軟件對pAFP-AGAP序列進行讀框(ORF)分析，然后用Translation程序推導并輸出氨基酸序列;應用網站提供的ProtParam方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進行蛋白理化性質分析。1.6?重組質粒實現(xiàn)細胞表達?HepG2細胞復蘇后置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素DMEM培

13、養(yǎng)液中，37 ，體積分數(shù)5 %CO2條件下培養(yǎng)。轉染前1 d，用新鮮無抗性培養(yǎng)液調整細胞密度為1105/mL，以每孔2 mL接種于6孔板培養(yǎng)過夜。次日將質粒pAFP/AGAP與脂質體(g/L)以1:3比例混合后轉染HepG2細胞，按LipofectamineTM 2000說明書操作。轉染后24 h，Trizol提取每孔細胞的RNA。RT-PCR 法檢測AGAP mRNA表達(條件同上)，其擴增產物電泳并測序鑒定。雙向測序由華大基因完成。2?結果2.1?AGAP基因克隆?提取的總RNA A260/A280比值為1.82，表明總RNA較純。以反轉錄的cDNA為模板，用設計的引物進行PCR擴增，所得

14、特異性條帶208 bp與預期長度相符(見圖2)。2.2?重組質粒酶切鑒定?重組質粒pAFP-AGAP經Nco?I和Xba?I雙酶切為201 bp和4?149 bp兩片段，Xba?I單酶切符合4?395 bp大小，還用Kpn?I和Xba?I雙酶切pAFP-AGAP便于觀察，得3?081 bp和1?308 bp兩個片段(見圖2)。2.3?生物信息學分析?pAFP-AGAP經雙向測序結果證實融合基因插入方向正確，經Gene bank Blast比對，有98%的堿基與GenBank序列相同，部分不同可能由基因突變或者基因克隆過程中錯配引起。結果顯示AGAP基因序列與原設計相符。重組質粒Vector NTI讀框分析表明，含AFP順式作用元件的真核表達載體pAFP-AGAP下游插入了完整的目的基因AGAP，起始密碼ATG，終止密碼TAG，編碼68個氨基酸。ProtParam分析顯示，該AGAP蛋白分子量：16?355.9 Da，等電點：5.36，分子式： C606H1010N204O257S34，半衰期： 30 h(哺乳動物)，不穩(wěn)定系數(shù): 20.97，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白。DNAStar軟件中的Protean程