反義雷帕霉素靶蛋白基因局部轉(zhuǎn)染對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響

1、反義雷帕霉素靶蛋白基因局部轉(zhuǎn)染對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響                作者：胡新華 張強(qiáng) 楊軍 劉程偉 張志深 楊德華  【摘要】目的：觀察以納米粒子為載體的反義雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部轉(zhuǎn)染對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響。方法：應(yīng)用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包載mTOR基因，制備納米級(jí)粒子混合物。檢測(cè)其包埋率、體外釋放情況及粒子大小。建立自體靜脈移植模型，隨機(jī)分成轉(zhuǎn)基因組、空載體組、對(duì)照組。

2、轉(zhuǎn)基因組移植靜脈轉(zhuǎn)染以納米粒子為載體的反義mTOR基因，空載體組單純轉(zhuǎn)染納米粒子包載的空載體，對(duì)照組不予特殊處理。分別于術(shù)后3d、7d、14d、28d取材，常規(guī)HE、Verhoeff染色，RTPCR、Western blot檢測(cè)mTOR基因的mRNA及蛋白的變化，TUNEL法觀察血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）凋亡的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)基因組內(nèi)膜中mTOR基因的mRNA及蛋白產(chǎn)物表達(dá)較其他兩組明顯減少（P0.05）；轉(zhuǎn)基因組內(nèi)膜增生厚度7d、14d、28d較其他組明顯減少（P0.01）；轉(zhuǎn)基因組凋亡細(xì)胞較其他組明顯增高（P0.05）。結(jié)論：納米粒子可以作為轉(zhuǎn)基因載體，反義mTOR基因的表達(dá)能夠有效抑制

3、自體移植靜脈內(nèi)膜的增生，促進(jìn)VSMC的凋亡。    【關(guān)鍵詞】雷帕霉素靶蛋白基因轉(zhuǎn)移，水平內(nèi)皮，血管靜脈移植，自體納米粒子    【ABSTRACT】Objective:To study the effect of antisense mammalian target of rapamycin(mTOR)gene transfection mediated by nanoparticles (NP)on neointimal formation in rat vein grafts.Methods:Nanoparticle antis

4、ense mTOR gene complex was prepared with PLGA package.The efficiency,release process in vitro and size of the complex were determined.Autogenous vein graft model was established in 72 rats by transplanting internal branch of jugular vein to carotid artery.Three groups were studied:(1)antisense mTOR

5、group:antisense mTOR gene mediated by NP were transfected into the veins before anastomosis.(2)Empty vector group:the vein were transfected by empty vector mediated by NP.(3)Control group(no transfection).The grafted veins were harvested 3 day,1 week,2 week and 4 week after the operation respectivel

6、y.The exogenous mTOR mRNA and protein expression were determined by RTPCR and Western blot.Intimal hyperplasia(IH) were observed by HE and Verhoeff stain.The presence of apoptotic VSMC was detected by TUNEL stain.Results:Antisense mTOR gene transfection mediated by nanoparticle complex enabled to in

7、hibit the mRNA and protein expression of mTOR gene(P0.05),and the IH was inhibited in the vein graft especially during 7d28d(P0.01).Conclusion:Nanoparticle is an effective gene transfecting carrier,and antisense mTOR gene expression can prevent the IH and promote apoptosis after vein grafting. 

8、   【KEY WORDS】Veins mTORGene transfer,horizontalTransplantation,autologousNanoparticleEndothelium,vascular     利用自體靜脈行冠狀動(dòng)脈搭橋或肢體旁路轉(zhuǎn)流手術(shù)，是目前挽救病人生命和肢體功能的重要手段。但是，血管移植后狹窄、閉塞使手術(shù)遠(yuǎn)期失敗率高達(dá)40%60%。哺乳類(lèi)動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與細(xì)胞的多種生理和病理過(guò)程，在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)

9、及增殖過(guò)程中起中心調(diào)控作用1。我們已經(jīng)成功構(gòu)建mTOR基因的反義RNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體2。本研究中，我們以納米粒子為載體局部轉(zhuǎn)染反義mTOR基因，觀察其對(duì)移植血管內(nèi)膜增生的影響。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料  Wistar大鼠72只，雌雄不拘，體重250300g。重組質(zhì)粒pEGPClmTOR為我們自行構(gòu)建。聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供。TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。mTOR多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

10、    1.2  納米微粒包載反義mTOR基因DNA質(zhì)粒  將反義mTOR基因pEGPClmTOR質(zhì)粒加入適量PLGA二氯甲烷溶液中，在冰浴條件下用高速攪拌器進(jìn)行乳化，形成油包水型乳液后，再加入PVA水溶液，攪拌形成均一的水包油包水乳液，于通風(fēng)櫥內(nèi)常壓下攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑2h，高速離心機(jī)離心20min，收集沉淀，水洗除掉游離的基因及PVA后，冷凍干燥。    1.3  納米粒子粒徑及分布的測(cè)定  采用激光子相關(guān)光譜儀（PCS美國(guó)Brookhaven公司），BI9000AT相關(guān)器，BI200SM光度

11、計(jì)，Innova304氬離子激光器（美國(guó)Coherent公司）于25±0.1，進(jìn)行激光光散射的測(cè)定。納米粒子表面形態(tài)的觀察：將包裝了pEGPClmTOR質(zhì)粒DNA的納米粒子溶于蒸餾水中，滴加于蓋玻片上，自然干燥，噴金掃描。         1.4  載基因納米粒子體外釋放試驗(yàn)  稱量含pEGPClmTOR質(zhì)粒DNA的納米粒子15.5mg,加入TE溶液中制成均一的懸浮液，將其放入雙室擴(kuò)散池的一側(cè)，兩池之間用0.22的濾膜隔開(kāi)，另一側(cè)為接收池，存放等體積新鮮的TE釋放液，將此雙室擴(kuò)散池置于37130

12、min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，每24h用新鮮緩沖液更換接收池中的釋放液，更換出的樣品直接用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)260nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算出釋放量繪制累積釋放曲線。    1.5  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及局部基因定位轉(zhuǎn)染  72只大鼠，隨機(jī)分成轉(zhuǎn)基因組、空載體組、對(duì)照組。轉(zhuǎn)基因組：移植靜脈轉(zhuǎn)染以納米粒子為載體的pEGPClmTOR質(zhì)粒?？蛰d體組：轉(zhuǎn)染納米粒子包載的pEGPCl空質(zhì)粒載體。對(duì)照組：不予特殊處理。每組24只，分別于術(shù)后3d、7d、14d、28d取材。建立大鼠自體靜脈移植模型：應(yīng)用顯微外科技術(shù)，取頸總靜脈內(nèi)側(cè)支5mm，轉(zhuǎn)基因組將移植靜脈段置

13、于已準(zhǔn)備好的DNA溶液（稱量DNA納米粒子6mg，加入生理鹽水0.3ml，制成均一的懸浮液）中30min后取出靜脈，切斷同側(cè)頸總動(dòng)脈，應(yīng)用110無(wú)創(chuàng)縫合線將靜脈段端端吻合于同側(cè)頸總動(dòng)脈；空載體組使用納米粒子包載的pEGPCl空質(zhì)粒；對(duì)照組使用生理鹽水。各組動(dòng)物分別于規(guī)定時(shí)間切取移植靜脈段，液氮中凍存。    1.6  形態(tài)學(xué)研究  參照文獻(xiàn)3，取部分標(biāo)本于10%中性福爾馬林液固定過(guò)夜。石蠟包埋后切片，作HE染色、Verhoeff彈力纖維染色。TUNEL法檢測(cè)VSMC凋亡。計(jì)算機(jī)圖像分析儀分析Verhoeff切片，測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度；分析TUNEL，計(jì)

14、算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。    1.7  RTPCR檢測(cè)反義mTOR基因的整合  根據(jù)反義mTOR序列設(shè)計(jì)引物：F：5AGGCCTTG GTGAGAGCTGTA3，R：5GGCACACATTTGAAGAAGCA3，產(chǎn)物長(zhǎng)度322bp；actin F：5TTCTGACCCATACCCACCAT3，R：5ATTACAGTGCGTGCTAAAGG3，產(chǎn)物長(zhǎng)度508bp。各取約100mg組織，按Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR過(guò)程：20L反應(yīng)體系，TaqDNA聚合酶0.5U，引物各50pmol。PCR反應(yīng)條件：94變性2min后，

15、9430s、5645s、7245s順序共循環(huán)30次，最后72延伸7min。電泳，凝膠成像系統(tǒng)上攝像并分析各條帶光密度值（基因表達(dá)值=mTOR/actin）。    1.8  Western blot檢測(cè)mTOR蛋白的表達(dá)  取組織加裂解液，勻漿，16000×g，4離心20min，取上清，測(cè)蛋白濃度；以50g上樣，經(jīng)10%SDS聚丙酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，與mTOR多克隆抗體結(jié)合1h，再與二抗結(jié)合30min后顯影，凝膠成像儀分析結(jié)果。    1.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)方

16、法  組內(nèi)差異采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。    2  結(jié)  果    2.1  納米粒子粒度的測(cè)定  光散射粒度分布圖可以看出，制備的載pEGPClmTOR質(zhì)粒DNA納米粒子的粒度集中分布在243343nm，平均粒度為288.9nm。粒徑呈窄分布，粒徑大小穩(wěn)定可靠，包封效率為60%，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得DNA含量為3%。粒子的體外釋放開(kāi)始階段存在爆破釋放，約1周后釋放量開(kāi)始穩(wěn)定，釋放曲線緩慢上升，平穩(wěn)維持釋放18d以上（圖1）。納米粒子掃描電鏡測(cè)定：電鏡掃描觀察載反義mTOR的

17、納米粒子，其直徑在300nm左右。    2.2  局部基因轉(zhuǎn)染結(jié)果  靜脈移植12周，熒光顯微鏡下可見(jiàn)有較多轉(zhuǎn)染基因表達(dá)，分布于移植靜脈中層及內(nèi)膜，見(jiàn)圖2；移植4周，轉(zhuǎn)染基因表達(dá)減少。圖2  熒光顯微鏡下觀察移植血管轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)（略）    2.3  形態(tài)學(xué)研究結(jié)果  各組均可見(jiàn)移植靜脈內(nèi)膜增厚,以1428d最為明顯。術(shù)后3d，對(duì)照組及空載體組的內(nèi)膜增生厚度與轉(zhuǎn)基因組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；術(shù)后7、14、28d，轉(zhuǎn)基因組內(nèi)膜增生程度明顯低于對(duì)照組及空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

18、（P0.01），見(jiàn)圖3；對(duì)照組及空載體組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見(jiàn)表1。表1  移植靜脈內(nèi)膜增生程度的比較（略）    2.4  TUNEL檢測(cè)凋亡結(jié)果  移植血管的凋亡細(xì)胞百分比在術(shù)后7d開(kāi)始增高，14d達(dá)高峰，28d有所下降；轉(zhuǎn)基因組凋亡細(xì)胞增加明顯，在術(shù)后14d及28d與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；空載體組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)學(xué)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見(jiàn)表2。表2  移植靜脈凋亡細(xì)胞百分比比較（略    2.5  RTPCR結(jié)果  轉(zhuǎn)基因組RNA經(jīng)RT

19、PCR擴(kuò)增后，可見(jiàn)特異性條帶322bp(圖4)；而空白對(duì)照組及空白納米粒子對(duì)照組未見(jiàn)特異表達(dá)條帶。這提示納米粒子可將外源反義mTOR基因?qū)胍浦惭懿⒈磉_(dá)。         2.6  Western blot檢測(cè)蛋白產(chǎn)物表達(dá)  空載體組及對(duì)照組在術(shù)后37d即出現(xiàn)mTOR蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，14d達(dá)到高峰，28d有所下降，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；轉(zhuǎn)基因組的mTOR蛋白產(chǎn)物表達(dá)在術(shù)后3d、7d、14d較對(duì)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見(jiàn)圖5。    圖5

20、  Western蛋白印跡檢測(cè)移植血管mTOR蛋白產(chǎn)物表達(dá)3  討  論基因治療的常用載體主要有腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物等。病毒載體存在一些問(wèn)題，如它們的免疫原性、原癌基因特性及一些未知的長(zhǎng)期作用，而非病毒的載體則不存在這些問(wèn)題。納米粒子是一種新興的非病毒基因載體，它可以使被包裹的DNA免受水解酶的降解。它在保護(hù)基因片段不受破壞的同時(shí)可以將目的基因定向運(yùn)載到血管內(nèi)的病灶部位，并能透過(guò)血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞（VSMC），使基因在細(xì)胞內(nèi)或周?chē)M織中長(zhǎng)期貯存和釋放，起到治療作用，提高轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定性4。本實(shí)驗(yàn)所用的PLGA納米粒子具有很好

21、的組織相容性，已經(jīng)應(yīng)用于臨床，在人體內(nèi)最終代謝產(chǎn)物為H2O和CO2，無(wú)任何毒性。本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒子大小在240350nm之間，包載效率0.3%，DNA通過(guò)滲透和擴(kuò)散的方式釋放出來(lái)，釋放時(shí)間為2周左右，屬較大顆粒的納米粒子。mTOR是防治PTCA術(shù)后再狹窄藥物雷帕霉素的作用靶蛋白?，F(xiàn)已證實(shí)，mTOR是一種分子量為289kDa的蛋白激酶，是3磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族（PI3Ks）中FK506結(jié)合蛋白（FKBP12）的相關(guān)蛋白。mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)及增殖過(guò)程中起中心調(diào)控作用，是細(xì)胞周期跨越G1/S期所必需的1。臨床研究結(jié)果表明，應(yīng)用雷帕霉素藥物洗脫支架可以將PTCA術(shù)后再狹窄率降低

22、90%以上5。深入研究mTOR信號(hào)通路可能揭示人類(lèi)許多疾病的發(fā)病機(jī)制或病理過(guò)程。在前期工作中，我們構(gòu)建了mTOR的反義基因表達(dá)質(zhì)粒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的VSMC，初步證實(shí)其能夠抑制VSMC的增殖，而其在體的作用及機(jī)制則有待于深入研究。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用納米技術(shù)包裹反義mTOR基因進(jìn)行局部轉(zhuǎn)染，通過(guò)動(dòng)物模型的在體實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步觀察反義mTOR基因的表達(dá)效果，以及其對(duì)自體移植靜脈內(nèi)膜增生程度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們成功檢測(cè)到反義mTOR的mRNA及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生受到顯著的抑制。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，納米粒子作為基因載體是可行的、有效的，而反義mTOR基因的表達(dá)能夠有效抑制自體移植靜脈內(nèi)膜的增生。我們推測(cè)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制VSMC增殖、促進(jìn)VSMC的凋亡而實(shí)現(xiàn)的。我們的研究也表明，促進(jìn)VSMC的凋亡可能是防治內(nèi)膜增生新的有效途徑6。因此，mTOR可能成為防治內(nèi)膜增生或移植血管狹窄、閉塞的新的藥物或基因干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)移植血管狹窄、閉塞機(jī)制研究有非常重要的作用。參  考  文  獻(xiàn)    1Fingar DC,Richardson CJ,Tee AR,et al.mTOR controls cell cycle progression