人胚胎造血的AGM區(qū)基質(zhì)細胞基因表達譜分析

1、人胚胎造血的AGM區(qū)基質(zhì)細胞基因表達譜分析    作者：付勁蓉，陳惠芹，張緒超，黃紹良，周敦華，黃科    【摘要】 為了篩選在主動脈-性腺-中腎（AGM）區(qū)基質(zhì)細胞中差異表達的基因，以藥物流產(chǎn)的孕30-35天的人胚胎AGM區(qū)來源基質(zhì)細胞為“實驗方”，以源自意外而致流產(chǎn)的孕4-5月的水囊引產(chǎn)的胎兒肝組織的基質(zhì)細胞為“驅(qū)動方”，建立了在人AGM區(qū)基質(zhì)細胞中差異表達基因的消減雜交文庫。進一步用基因芯片技術(shù)對所建立的抑制消減雜交文庫進行篩選，并挑選其中明顯差異表達的18個克隆進行序列測定和同源性分析。結(jié)果表明： 在所構(gòu)建

2、的AGM抑制消減雜交文庫中，經(jīng)過PCR鑒定有特異性擴增帶且擴增帶分子量在200-700 bp的克隆有211個，陽性率高達76.4。經(jīng)過基因芯片篩選，挑選出ratio值大于5的克隆共18個進行序列測定顯示，在測序的18個明顯差異表達的陽性克隆中，4個為未知基因，14個為已知基因，其中這些已知基因分別參與了細胞遷移、分化、生長、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導及血管發(fā)生等細胞重要生命過程。這些基因大多數(shù)在胚胎分化造血發(fā)育中的作用尚未見報道。結(jié)論 篩選AGM區(qū)基質(zhì)細胞中差異表達的基因為進一步研究胚胎造血發(fā)育的分化調(diào)控的分子機理提供了必要的理論基礎。    【關(guān)鍵詞】 AGM

3、區(qū)；胎肝；基質(zhì)細胞；抑制消減雜交；基因芯片 Screening and Cloning the Genes Differentially Expressed in Human Embryonic AGM-Derived Stromal Cells Abstract To screen and separate the genes differentially expressed in human embryonic aorta-gonad-mesonephros(AGM)-derived stromal cells，a subtracted library was generated thro

4、ugh the suppression subtractive hybridization using the cDNA of human embryonic AGM-derived stromal cells as target and human fetal liver(FL)-derived stromal cells as drivers. Then a high though screening technique，gene chip，was used to screen the differentially expressed genes in the established su

5、btractive library. Approximately 18 of the resulting subtracted cDNA clones were partially sequenced and analyzed by blastn in the GenBank database. The results showed that 211 Clones were selected and identified from the established subtractive library，the positive ratio was amount to 76.4%. 18 ove

6、r-expressed genes were screened by gene chip with more than a 5-fold difference expression levels between AGM and FL-derived stromal cells，and were selected to sequence，results of sequencing indicated that the 18 sequences was compared to known sequences in the GenBank database， and among the sequen

7、ced clones，14 sequences were considered as part of the known genes，and 4 sequences representing previously unknown genes. The known gens were reported to involve the regulation of cell migration，cell differentiation，cell proliferation，cell cycle，signal transduction，and angiogenesis. Most of these ge

8、nes have not been reported to relate to the haematogenesis in ontogeny. It is concluded that many genes both known and unknown are differentially expressed in human embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells. Discovery of these genes provides a solid foundation to elucidate the mechanis

9、m of haematogenesis in ontogeny. Key words    AGM region; fetal liver; stromal cell； suppression subtractive hybridization; gene chip    主動脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros，AGM）區(qū)近年來被認為是永久造血干細胞（definitive HSC）出現(xiàn)的最早區(qū)域，為胚胎造血發(fā)生提供了必要的啟始條件1，正成為國際上造血分化機理研究中的熱點2，3，但其具體的

10、分子機制仍不清楚。本研究建立了人AGM及胎肝（fetal liver，F(xiàn)L）基質(zhì)細胞的抑制消減雜交文庫，為闡明胚胎造血發(fā)育的分化調(diào)控的分子機理提供線索。 材料和方法 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自Gibco公司。總RNA提取試劑TRIZOL購自上海生工公司。mRNA分離試劑盒-Oligotex mRNA kit購自德國Qiagen公司，抑制消減雜交試劑盒PCR-Select TM cDNA subtraction kit購自購自美國Clontech公司。A-T clone試劑盒InsT/AcloneTM PCR product kit購自立陶宛Fermentas公司。大腸桿菌JM10

11、9購自大連TaKaRa Biotech公司。 基質(zhì)細胞 按照本室方法建立的人AGM區(qū)基質(zhì)細胞（hAGMS3）4，在含15%的胎牛血清的IMDM中傳至第6代，用于實驗；人胎肝基質(zhì)細胞取自因意外致流產(chǎn)的孕4-5月的水囊引產(chǎn)的胎兒肝組織，用胰蛋白酶消化法獲得基質(zhì)細胞，傳至第6代用于實驗。 AGM及FL基質(zhì)細胞的鑒定 采用流式細胞儀檢測細胞膜表面分子CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD105的表達。 AGM基質(zhì)細胞抑制消減雜交文庫的建立 利用Clontech公司PCR-SelectTM cDNA subtraction kits，以FL基質(zhì)細胞細胞作為“驅(qū)動方（driver）”，AG

12、M基質(zhì)細胞作為“實驗方（tester）”進行抑制消減雜交，將兩次消減雜交的產(chǎn)物經(jīng)過兩輪PCR反應擴增后，利用Fermentas IinsT/AcloneTM PCR product kit將其克隆到PUC57/T 載體，經(jīng)過藍白斑篩選，挑選白色菌落（陽性克?。┘传@得HL-60/DNR抑制消減雜交文庫。 抑制消減雜交文庫的基因芯片篩選 將抑制消減雜交文庫中的211個陽性克隆經(jīng)PCR擴增后，純化產(chǎn)物，并與一定量的植物基因（排除外源性污染）、管家基因（作為陽性質(zhì)控及兩種熒光信號強度的校準）、空白對照組成324陣列，利用Cartesian Psys5500芯片點樣儀以針點（pin printing）的

13、形式將每個克隆有序地點在氨基化修飾的載波片上。然后分別與cy3及cy5熒光信號標記的AGM及FL基質(zhì)細胞的cDNA探針進行雜交，經(jīng)過不同嚴謹度的洗片，激光共聚焦掃描儀讀取熒光信號，利用ImaGene軟件包進行掃描信號分析，進而確定各個克隆所代表的基因在AGM及FL兩種基質(zhì)細胞中的相對表達強度，共制作4張芯片以利于信號綜合分析。    差異表達基因克隆序列的測定 選取在AGM中呈明顯差異表達（基因芯片ratio值大于5）的18個克隆進行序列測定。由大連寶生物公司協(xié)助完成。所用測序引物為克隆載體pUC57/T多克隆位點上游通用引物序列M13-47即CGCCA

14、 GGGTT TTCCC AGTCA CGAC，由大連寶生物公司合成。測序反應試劑為ABI PRISM(r) Big DyeTMterminator cycle sequencing ready reaction kit with amplitaq DNA polymerase （Applied Biosysterms），測序儀為ABI PRISMTM377XLL DNA sequencer。 差異表達基因同源性分析 與公共數(shù)據(jù)庫（GeneBank nonredundant database）作DNA序列同源性比較，對于所測定的序列與公共數(shù)據(jù)庫（GeneBank nonredundant da

15、tabase）用Blastn軟件進行DNA序列同源性比較。通過Internet進入/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jfrom=1，按照說明填寫Submit sheet，選擇合適參數(shù)，實現(xiàn)在線DNA序列的同源性比較。 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以X±SD表示，采用t檢驗分析。    結(jié) 果 AGM及FL基質(zhì)細胞的形態(tài)及表型 體外培養(yǎng)中第6代AGM及FL基質(zhì)細胞生長良好，以梭形成纖維細胞為主（圖1）。流式細胞儀細胞表型檢測結(jié)果顯示，兩株基質(zhì)細胞系均高表達CD44、CD29，中等強度表

16、達CD105，不表達CD34、CD45、CD14（表1），符合基質(zhì)細胞的特征。 AGM來源基質(zhì)細胞抑制消減雜交文庫的建立 兩次消減雜交及PCR的產(chǎn)物經(jīng)過A-T克隆連接到PUC57/T載體后，經(jīng)過Amp抗性和LacZ基因特異性的藍白斑篩選，共挑選出276個菌落，用第2次PCR的引物擴增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)有特異性擴增條帶（圖2），切所擴增片段分子量在400-700 bp的克隆共有211個，陽性率高達76.4%。 基因芯片技術(shù)的檢測 掃描圖象圖2、圖3分別顯示了1次Cy3及Cy5標記的探針與芯片雜交的結(jié)果，分別顯示了抑制消減雜交文庫中各個克隆在FL及AGM基質(zhì)細胞中相對表達強度，經(jīng)過計算

17、機處理用不同顏色代表不同的表達強度，其中白色點為超高表達，表示信號表達達到飽和狀態(tài)，其他點由紅-藍-黑色代表信號由強到弱。將4張芯片的結(jié)果綜合分析后，經(jīng)過篩選挑選出ratio值(差異表達倍數(shù))大于3的克隆共有46個即差異表達克隆，其中ratio值大于5的明顯差異表達的克隆共有18個。Table 1. Results of cellular phenotype detected by flow cytometry （略） 差異表達基因克隆序列的測定及同源性分析 利用Blastn軟件將所獲得的EST序列與公共數(shù)據(jù)庫GeneBank nonredundant database 作DNA序列同源性分析

18、。在所測序的18個克隆中，發(fā)現(xiàn)其中4個序列是未知序列，其中14個序列為已知序列，同源性分析結(jié)果如表2所示。Table 2. Results of homology analysis of 14 known clones（略） 討 論 在胚胎造血發(fā)育過程中造血微環(huán)境存在明顯的變遷，先后經(jīng)歷了由卵黃囊（YS）、主動脈-性腺-中腎區(qū)（AGM）、胎肝（FL）到骨髓（FBM）遷移過程。至今，造成這種造血個體發(fā)育中造血微環(huán)境遷移的機制仍不清楚。基質(zhì)細胞是造血微環(huán)境中最重要的構(gòu)成成分，毫無疑問，若能探明造血個體發(fā)育中不同基質(zhì)細胞的基因表達的模式，找出在個體發(fā)育不同階段（時空）中差異表達的起決定作用的基因，將

19、對全面揭示造血個體發(fā)育的機制具有重要意義。    胚胎期造血分為原始造血(primitive hematopoiesis)和永久造血（definitive hematopoiesis）。在原始造血過程中，位于胚外的卵黃囊產(chǎn)生有核紅細胞，提供胚胎生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。隨著胚胎的發(fā)育，原始造血被永久的多系造血所取代，永久造血的多能造血干細胞（HSC）具有自我更新和多向分化的能力。長期以來認為永久造血也是起源于胚外卵黃囊，然而近年來研究表明位于胚內(nèi)的AGM區(qū)是永久HSC的起源部位3。在孕27-38天的人胚胎中約有800個HSC聚集在上肢芽水平的背主動脈中5，

20、由于AGM區(qū)是永久HSC的最早產(chǎn)生部位，推測AGM區(qū)存在有利于HSC發(fā)育的造血微環(huán)境6。Xu等3從孕10.5天小鼠胚胎中分離出AGM區(qū)組織，建立AGM區(qū)基質(zhì)細胞系，發(fā)現(xiàn)以AGM區(qū)基質(zhì)細胞（AGM-S3）作飼養(yǎng)層，在不加造血生長因子的情況下亦可擴增人臍血的CD34細胞達5.3倍，而成年鼠骨髓基質(zhì)細胞體系僅擴增2.3倍。而且AGM-S3不僅擴增CD34CD38細胞，還可擴增CD34CD38-細胞，對人長期重建HSC亦有支持作用。本課題組建立的hAGMS3同樣具有支持長期造血作用（另文發(fā)表）。但至今，AGM區(qū)基質(zhì)細胞通過何種機制吸引HSC及其前體細胞在此處定置、擴增并最終發(fā)育成功能完善的造血細胞的分

21、子機制仍不清楚。    為探討AGM區(qū)參與調(diào)控胚胎造血分化、發(fā)育的分子機理，我們采用抑制消減雜交結(jié)合高通量信息分析技術(shù)?基因芯片技術(shù)，克隆和篩選AGM區(qū)基質(zhì)細胞較胎肝基質(zhì)細胞中差異表達的基因7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管AGM區(qū)基質(zhì)細胞在細胞生長特性、形態(tài)等方面與胎肝基質(zhì)細胞無明顯差異，但是其基因表達譜較野生型胎肝基質(zhì)細胞存在明顯的差別。本次實驗中篩選出在AGM基質(zhì)細胞中差異表達上調(diào)的基因就有46個，其中明顯差異表達上調(diào)（差異倍數(shù)達到5倍以上）的有18個。進一步對這18個克隆進行序列測定和基因同源性分析，我們發(fā)現(xiàn)，其中4條是全新的序列（另文報道），而其余的均為已知基

22、因，這些已知基因主要為以下幾類基因 細胞凋亡相關(guān)基因：如AFO27302、AF229832；與細胞能量代謝及生物氧化相關(guān)酶類：如X76648、M22877； 細胞信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因；如AF037989、AF043045；細胞遷移與運動有關(guān)的基因，如NM002531; 血管生成相關(guān)基因，如NM018060、NM000459及;與細胞分化發(fā)育有關(guān)的基因，如NM014564、X68879。    隨著近年對造血細胞分化、發(fā)育調(diào)控機制的深入研究，一些與細胞分化、發(fā)育、增殖的基因逐漸引起人們的重視。本研究所發(fā)現(xiàn)，在AGM基質(zhì)細胞中特異表達上調(diào)的眾多基因中有兩類基因引

23、起我們注意，其一是與分化發(fā)育調(diào)控的基因如同源盒基因Lhx3及Emx2，既往研究表明Lhx3及 Emx2在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)等重要組織、器官的發(fā)育中中扮演重要角色8，9，但至今尚未見其參與胚胎造血分化、發(fā)育調(diào)控的報道，其在AGM調(diào)控造血細胞發(fā)生與發(fā)育中的作用更是不得而知，值得我們進一步證實與探討；另一類基因是與血管及其內(nèi)皮細胞發(fā)育有關(guān)的基因如TEK及HEY210，11，血管內(nèi)皮細胞作為造血微環(huán)境中最重要的組成部分，近年血管發(fā)生與造血器官分化與發(fā)育之間的關(guān)系日益引人關(guān)注，無疑這些與血管發(fā)生有關(guān)的基因的篩出將為我們闡明AGM區(qū)血管發(fā)生與造血器官分化與發(fā)育之間的關(guān)系提供重要的線索，值得進一步研究。 

24、;   【參考文獻】 1 Nobuhisa I，Kato R，Inoue H，et al. Spred-2 suppresses aorta-gonad-mesonephros hematopoiesis by inhibiting MAP kinase activation. J Exp Med，2004; 199: 737-7422 Xu MJ，Tsuji K，Ueda T，et al. Stimulation of mouse and human primitive hematopoiesis by murine embryonic aorta-gonad-

25、mesonephros-derived stromal cell lines. Blood，1998; 92: 2032-20403 Tavian M，Robin C，Coulombel L，et al. The human embryo，but not its yolk sac，generates lympho-myeloid stem cells: mapping multipotent hematopoietic cell fate in intraembryonic mesoderm. Immunity，2001; 15: 487-4954 陳惠芹，張緒超，黃紹良等. 人AGM區(qū)基質(zhì)細

26、胞系的建立及其生物學特性. 中山大學學報?醫(yī)學科學版，2005； 26：20235 Tavian M，Coulombel L，Luton D，et al. Aorta-associated CD34 hematopoietic cells in the early human embryo. Blood，1996; 87: 67-726 Robin C，Dzierzak E. Hematopoietic stem cell enrichment from the AGM region of the mouse embryo. Methods Mol Med，2005，105:257-2727 Bangur CS，Switzer A，F(xiàn)an L，et al. Identificati