硫酸軟骨素總述

1、.硫酸軟骨素一、產(chǎn)品簡介 :硫酸軟骨素是來自動物軟骨組織的一類天然的酸性粘多糖（因其具有粘稠性） 糖胺聚糖 （其中糖胺聚糖作為動物蛋白聚糖的代表成分，在軟骨組織中以蛋白多糖形式存在），不同動物體內(nèi)所存在的硫酸軟骨素類型不同，主要是CAS、CSC 及各種硫酸軟骨素的混合物，其中豬牛羊的骨中主要含有硫酸軟骨素A，鯊魚烏賊等海洋動物的軟骨中主要含有硫酸軟骨素C。區(qū)別：蛋白多糖以蛋白為核心，糖蛋白以多糖為主體；或者說側(cè)重點不同，雖然組成成分是一樣的，但是糖蛋白定義為蛋白，蛋白聚糖定義為糖。糖胺聚糖： 1）蛋白聚糖由三部分組成 -核心蛋白、糖胺聚糖、連接區(qū)寡糖； 2）糖胺聚糖除了通過共價鍵與蛋白聚糖的核

2、心蛋白連接(糖肽鍵）外，糖胺聚糖還通過靜電作用或立體化學(xué)效應(yīng)與其他蛋白質(zhì)發(fā)生專一性程度不同的結(jié)合。 而蛋白多糖的聚集體則通過次級鍵（氫鍵和鹽鍵） 形成，可見從軟骨組織中提取硫酸軟骨素僅依靠破壞次級鍵的方法是不夠的， 而必須以降解蛋白質(zhì)的方法， 破壞多糖鏈與蛋白的共價結(jié)合方能達到提取硫酸軟骨素的目的； 3）因為糖胺聚糖具有粘稠性，所以蛋白聚糖也被稱為粘蛋白。 軟骨中粘蛋白等中的糖胺聚糖多由兩種氨基己糖 （氨基葡萄糖和氨基半乳糖） 之一和兩種己糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸） 之一以各種糖苷鍵連接而成； 4）除透明質(zhì)酸（屬于非蛋白多糖提?。┩?，糖胺聚糖分子中的氨基己糖.上均含有硫酸基，該硫酸基與己

3、糖醛酸上的羧酸都會導(dǎo)致整個蛋白聚糖分子顯酸性，所以糖胺聚糖又被稱為酸性粘多糖。二、理化性質(zhì) :1、物理性質(zhì)：硫酸軟骨素，簡稱CS，分子式：（C14H21NO14S)n，成品外觀白色粉末狀，無臭無味，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮、冰醋酸等有機溶劑，遇水后迅速膨脹，對熱不穩(wěn)定，需避光密封保存。其分子中含有大量的硫酸基和羧基，故呈酸性反應(yīng)， 可與鈉鉀鈣離子結(jié)合成鹽，其鹽類對熱穩(wěn)定。在高溫、堿性、酸性環(huán)境溶液中易水解成單糖或小分子量多糖，因而溶液粘度下降。（游離的硫酸軟骨素水溶液遇較高溫不穩(wěn)定， 主要是乙酰基被水解， 從其結(jié)構(gòu)上脫落下來。）2、化學(xué)性質(zhì)：硫酸軟骨素是來自動物軟骨組織的一類天然的酸性粘多糖

4、糖胺聚糖。硫酸軟骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替連接而成的直鏈分子，作為動物糖胺聚糖中的代表物質(zhì)，硫酸軟骨素由D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-氨基半乳糖（結(jié)構(gòu)圖如下所示）以1,3 糖苷鍵連接形成雙糖，雙糖單位之間以1,4 糖苷鍵連接。一般硫酸軟骨素約含有50-70 個雙糖單位，動物組織中的硫酸軟骨素平均分子量約為260000。在分子結(jié)構(gòu)上硫酸軟骨素氨基己糖環(huán)的4 位或 6 位可硫酸化。.圖1圖2圖 7圖 5注：乙酰不是一種物質(zhì)，它是一種基團，或者說是官能團，是乙酸去掉羥基后剩下的部分，寫為 -COCH3 。硫酸軟骨素常見化學(xué)反應(yīng)有降解反應(yīng)， 硫酸軟骨素不僅在高溫強酸條件下易發(fā)生降解反應(yīng)， 使其

5、分子量降低， 同時在硫酸軟骨素裂解酶等的作用下也可發(fā)生降解。 其中硫酸軟骨素可被濃硫酸降解成小分子組分，并被硫酸化， 降解的程度和硫酸化的程度隨著溫度的升高而增加，在 30 -50溫度下， 2h 可使平均分子量降至 3000-4000；也可在稀鹽酸溶液中水解而成為小分子產(chǎn)物，溫度越高水解速率越快。硫酸軟骨素是一種聚陰離子的高分子化合物，多數(shù)含有 -SO3H 和.-COOH 等基團，易與Na、 K 、 Ca2、 Mg2等陽離子結(jié)合，故其都是以金屬鹽成分制成藥品。根據(jù)糖胺聚糖雙糖中單糖分子類型、羧基和硫酸基位置的不同，可將其分為透明質(zhì)酸、 硫酸軟骨素 A、硫酸軟骨素 C 等幾類。其中透明質(zhì)酸又稱玻

6、璃酸，組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖；硫酸軟骨素 A 組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-半乳糖 -4-硫酸；硫酸軟骨素 C 組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-半乳糖 -6-硫酸；由此可見透明質(zhì)酸為糖胺聚糖中唯一的非硫酸化多糖， 其他糖胺聚糖的硫酸化位置和數(shù)量與其生理功能密切相關(guān)。三、分離提純原理及方法簡介:1、制備原理硫酸軟骨素屬于酸性粘多糖， 目前酸性粘多糖的提取方法主要有降解法和非降解法。非降解法僅用于非蛋白多糖的粘多糖 -透明質(zhì)酸。降解法適用于包括透明質(zhì)酸在內(nèi)的所有酸性粘多糖， 其主要包括堿鹽法、堿提取法、酶提取法、超聲波法等。1）堿提取法：是基

7、于硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合的 O-糖苷鍵可在堿作用下發(fā)生消去反應(yīng)， 使糖肽鍵斷裂， 硫酸軟骨素從蛋白多糖中釋放出來， 但在強堿作用下硫酸軟骨素也易發(fā)生降解。2）鹽法提取：基于一定離子強度下軟骨中的某些蛋白質(zhì)會產(chǎn)生沉淀，從而實現(xiàn)硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離的目的。3）堿鹽法：利用堿性條件下，連接硫酸軟骨素和蛋白質(zhì)的糖肽鍵發(fā)生斷裂，使硫酸軟骨素以游離態(tài)釋放，并且通過控制一定的離子.強度，使軟骨中的某些蛋白質(zhì)沉淀析出，便于濾除。一定范圍內(nèi)，提取物中硫酸軟骨素的含量和得率是隨著堿液濃度的增加而提高。4）超聲輔助法：是利用超聲波的空化作用，使物料周圍形成空穴，從而有利于硫酸軟骨素提取的方法。 原理是在堿性條件下

8、蛋白質(zhì)易離解和超聲波的熱學(xué)機制可促進蛋白質(zhì)快速解離而達到去雜蛋白質(zhì)的目的，升溫（ 85-90）均可使解離的蛋白質(zhì)變性吸附到白陶土上，從而使硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離， 提高產(chǎn)品質(zhì)量。 采用超聲輔助的堿提酶解法提取硫酸軟骨素， 其提取物中硫酸軟骨素的含量和得率并無明顯提高，但可大大縮短提取時間。5）酶法： 軟骨中的膠原蛋白和粘蛋白等在中性或弱酸性條件下是可溶的，不易被分離除去。 酶法是利用不同蛋白酶水解蛋白質(zhì)的特異性，使蛋白質(zhì)水解成氨基酸， 再利用硫酸軟骨素與氨基酸的溶解性不同將其提取出來的方法。 酶法條件溫和， 不易引起硫酸軟骨素的降解，常用的酶制劑有胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋

9、白酶等。提取物含氮量越低，表明提取物中的雜質(zhì)蛋白含量越少。2、純化方法溶劑法：是利用軟骨中不同化學(xué)成分的溶解性差異， 而將硫酸軟骨素與其它雜質(zhì)相互分離的純化方法。 硫酸軟骨素含有的硫酸基、 羧基和羥基等親水性基團，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有機溶劑。超濾膜法：是利用濾膜孔徑的不同使硫酸軟骨素與其它非多糖類雜質(zhì)分離，而得到分子量范圍較窄且純度較高的硫酸軟骨素的方法。.季銨鹽沉淀法： 硫酸軟骨素在溶液中以聚陰離子形式存在， 與季銨鹽類化合物形成水溶性很小的季銨鹽絡(luò)合物， 這些絡(luò)合物在低離子強度的水溶液中不溶解， 但當(dāng)其增大到臨界離子強度時， 可發(fā)生解離并溶解，利用該性質(zhì)可使硫酸軟

10、骨素得到分離純化。離子交換色譜法：是依靠庫侖力的作用將物質(zhì)吸附在交換劑上，然后選用合適的洗脫劑進行洗脫， 達到其純化的目的。 常用于硫酸軟骨素純化陰離子交換劑有樹脂、纖維素和葡聚糖凝膠等。電泳法：根據(jù)化合物所帶電荷類型和數(shù)量的不同， 采用電泳法可將硫酸軟骨素和其他雜質(zhì)分離開。 電泳法具有分辨率、 目標純度和回收率較高的特點。四、酶法制作工藝實驗流程：1、具體提取方法：從鱘魚頭中取出軟骨，洗凈，切成小塊，置于大燒杯中 100水浴加熱 12h，中途換水兩次以除去表層油脂，冷卻后漂洗，瀝干水后送入 60干燥箱干燥約 5h，干燥完全后粉碎得到軟骨粉。.稱取一定量軟骨粉， 根據(jù)一定的固液比加蒸餾水溶解酶

11、， 放入搖床恒溫反應(yīng)，反應(yīng)時間中間時刻調(diào)加入胃蛋白酶直至反應(yīng)完全。 反應(yīng)液水浴加熱進行酶滅活處理，冷卻后調(diào)至中性，離心取清夜，并加入清液體積的兩倍乙醇進行沉淀， 邊加入乙醇邊攪拌， 放入冰箱靜置24h，離心取沉淀，沉淀送入 50干燥箱干燥約 3h，得硫酸軟骨素粗品。酶反應(yīng)溫度過高會引起酶失活， 溫度過低酶活性不高， 木瓜蛋白酶最適溫度 50 60，胃蛋白酶不耐低溫，胰蛋白酶最適溫度為 45. 本實驗綜合三種酶最適溫度，設(shè)定反應(yīng)溫度為 38，故溫度不作為單因素考慮。1）酶濃度因素：酶濃度不同，其他因素相同，隨著酶濃度的提高，粗品提取率隨之升高， 但酶濃度升高到一定值（ 15mg/g), 提取率不

12、再增大。2）時間因素：反應(yīng)時間不同，其他因素相同，隨著反應(yīng)時間的增長，粗品提取率隨之升高，但反應(yīng)時間超過50h，提取率雖然有所增長，但增長空間不大。 另外，提取時間過長， 得到的產(chǎn)品顏色加深，提取時間應(yīng)以軟骨全部溶解為準。3）固液比因素：固液比不同，其他因素相同，隨著固液比的增高，粗品提取率隨之升高，但固液比升高到一定值（1:12 ），提取率不再增大。原理：硫酸軟骨素分子具有很高的吸濕性，因為其中的硫酸軟骨素分子是以多聚陰離子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附帶正電.荷的水分子，吸附相當(dāng)于自身重量的數(shù)百倍的水分。在反應(yīng)體系中，大部分水分子和硫酸軟骨素因靜電作用結(jié)合， 并非游離態(tài)，因此反應(yīng)溶液的粘度

13、大，結(jié)合酶動力學(xué)說，底物分子與酶分子的碰撞概率減小，反應(yīng)速率低。故高固液比，可使溶液變稀，降低溶液的粘度，從而提高提取率。2、硫酸軟骨素各項指標測定方法1 ）葡萄糖醛酸含量測定采用咔唑比色法，繪制葡萄糖醛酸標準曲線2 ）樣品純度測定采用咔唑比色法，繪制硫酸軟骨素標準曲線3 ）蛋白質(zhì)的標定取不同濃度牛血清白蛋白， 采用考馬斯亮藍法， 測其 595nm處吸光度，繪制標準曲線。4 ）脂肪含量測定依據(jù) GB50009.6-85，索氏抽提法測定硫酸軟骨素中脂肪含量。5 ）PH測定五、綜述1 、原料中除含有蛋白多糖外， 還有大量的蛋白質(zhì)、 無機鹽、脂肪、結(jié)締組織及殘留的肌肉。 為了提高硫酸軟骨素的純度， 首先應(yīng)盡量去除軟骨上的肌肉、脂肪、結(jié)締組織；其次，應(yīng)將軟骨盡量粉碎，以提高提取率和降低浸提時間； 另外，硫酸軟骨素的提取率和純度高低與所采用的原料部位有關(guān)。.2、酶法反應(yīng)條件溫和，操作簡單，不會引起硫酸軟骨素的降解，固液比越高， 得率越高，最后達到平衡。 但快速反應(yīng)也可能使反應(yīng)體系升溫，引起蛋白質(zhì)和粘多糖的分解并