研8免疫印跡技術(shù)2剖析

1、免疫印跡技術(shù)免疫印跡技術(shù)Western Blot 凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳的方式轉(zhuǎn)印至的方式轉(zhuǎn)印至固相支持物固相支持物上上三、轉(zhuǎn)膜三、轉(zhuǎn)膜1.1.轉(zhuǎn)印膜比較轉(zhuǎn)印膜比較2.2.原理：將膜與膠放在中間，上下加濾紙?jiān)恚簩⒛づc膠放在中間，上下加濾紙數(shù)層，做成數(shù)層，做成“Sandwich”Sandwich”樣的轉(zhuǎn)移單位，樣的轉(zhuǎn)移單位，并且保證帶負(fù)電的蛋白質(zhì)向陽極轉(zhuǎn)移，并且保證帶負(fù)電的蛋白質(zhì)向陽極轉(zhuǎn)移，即膜側(cè)連接陽極或面向陽極（如圖）。即膜側(cè)連接陽極或面向陽極（如圖）。v這種方法是用有孔的塑料和濾紙這種方法是用有孔的塑料和濾

2、紙將凝膠和將凝膠和PVDFPVDF膜夾成膜夾成“三明治三明治”形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場力的作用下離開凝膠結(jié)合到電場力的作用下離開凝膠結(jié)合到PVDFPVDF膜上。膜上。(1)PVDF(1)PVDF膜和濾紙的預(yù)處理：剪裁適當(dāng)大小膜和濾紙的預(yù)處理：剪裁適當(dāng)大小的的PVDFPVDF膜，將其浸入甲醇液中浸泡膜，將其浸入甲醇液中浸泡10s10s（快速激活（快速激活PVDFPVDF膜），去離子水處理膜），去離子水處理5min5min，1 1轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡轉(zhuǎn)移緩沖

3、液浸泡10min10min以上。以上。3.3.操作操作(2)(2)剪裁比膜略小的剪裁比膜略小的6 6層濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖層濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用。液浸泡后待用。(4)(4)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 負(fù)極負(fù)極纖維帕纖維帕三層濾紙三層濾紙樣品膠樣品膠PVDFPVDF膜膜三層濾紙三層濾紙纖維帕纖維帕正極正極(5)(5)正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線，使電荷由負(fù)極正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線，使電荷由負(fù)極向正極流動。接通電源，恒流轉(zhuǎn)膜向正極流動。接通電源，恒流轉(zhuǎn)膜2h2h，2mA/cm2mA/cm2 2膜。此操作宜在膜。此操作宜在44冰箱中進(jìn)行。冰箱中進(jìn)行。(3)(3)取下電泳板，將其平置，去掉上層玻璃取下電泳板，將其平置，去掉上

4、層玻璃板，切除多余凝膠。板，切除多余凝膠。(6)(6)轉(zhuǎn)膜完畢后小心取出轉(zhuǎn)移膜，在轉(zhuǎn)膜完畢后小心取出轉(zhuǎn)移膜，在1 1TBSTTBST液中漂洗兩次液中漂洗兩次; ;(7)(7)將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染液中，檢查蛋將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染液中，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。（此步驟可省略）白轉(zhuǎn)移是否完全。（此步驟可省略）(8)(8)轉(zhuǎn)膜后檢測：麗春紅染膜（可省略）轉(zhuǎn)膜后檢測：麗春紅染膜（可省略）四、封閉四、封閉1.1.目的：為避免作為檢測試劑的特異性第目的：為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位異性背景提高，需對膜上的

5、潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。2.2.封閉的原理：用非抗原的蛋白去封閉膜，封閉的原理：用非抗原的蛋白去封閉膜，避免抗體固定在非特異性膜上而引起高避免抗體固定在非特異性膜上而引起高背景。背景。3.3.可用的封閉劑：可用的封閉劑：（1 1）5%5%脫脂奶粉或脫脂奶粉或BSABSA（室溫孵育（室溫孵育1h1h）（2 2）Western Blot Western Blot 膜封閉液（生物試劑膜封閉液（生物試劑公司）公司）（3 3）Tween-20Tween-20：減少非特異性吸附，不：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。影響抗體與抗原的結(jié)合。五、一抗、二抗雜交五、一抗、二抗雜交v把把

6、NCNC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以膜面積以0.1mL/cm20.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育上平緩搖動，于室溫孵育1-21-2小時(shí)或小時(shí)或44過夜。過夜。v回收一抗溶液，用回收一抗溶液，用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min10min。v加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育于室溫孵育1-21-2小時(shí)或小時(shí)或44過夜。過夜。 v回收二抗溶液，用回收二抗溶液，用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min

7、10min。v最后用最后用TBSTBS漂洗膜漂洗膜2 2次，每次次，每次10min10min。六、檢六、檢 測測v根據(jù)標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記AbAb2 2的標(biāo)記物不同的標(biāo)記物不同, ,其雜交其雜交的結(jié)果檢測方法也不同的結(jié)果檢測方法也不同, ,較常用的檢較常用的檢測系統(tǒng)有測系統(tǒng)有HRPHRP標(biāo)記標(biāo)記AbAb2 2的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光光(ECL)(ECL)和和DABDAB檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng). .（1 1） 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶-DAB-DAB法法: :DABDAB顯色液的配制顯色液的配制: :按照按照1mlH1mlH2 2O O加顯色劑加顯色劑A,B,CA,B,C各各1 1滴滴, ,混勻混勻.

8、.顯色顯色: :將適量將適量DABDAB顯色液平鋪在顯色液平鋪在AbAb2 2雜交后雜交后（洗畢）的印跡膜上（洗畢）的印跡膜上, ,室溫放置觀察室溫放置觀察, ,可出現(xiàn)可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶明顯的棕褐色蛋白顯色帶終止終止: :用用Tris-HClTris-HCl緩沖液或水漂洗雜交膜即緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng)可終止反應(yīng). . （2 2） 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶-ECL-ECL法法: :增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)(ECL)檢測是利用辣根過氧檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì), ,生成一種不穩(wěn)生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì)定的中間物質(zhì), ,其衰變時(shí)在暗室內(nèi)形成明其衰變時(shí)在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶, ,利用利用X X線膠線膠片感光原理片感光原理, ,將結(jié)果記錄下來。將結(jié)果記錄下來。 設(shè)計(jì)