第二章酶的生產(chǎn)與分離純化(1)

1、第二章第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化酶的生產(chǎn)與分離純化(2學(xué)時(shí)，共4學(xué)時(shí))主要內(nèi)容主要內(nèi)容 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀酶的發(fā)酵技術(shù)酶的分離純化1 1 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀1.1 酶制劑的生產(chǎn)及新技術(shù)的應(yīng)用酶制劑的生產(chǎn)及新技術(shù)的應(yīng)用 ：酶制劑的生產(chǎn)的三種方法：n組織提?。耗竟系鞍酌浮⒛榈鞍酌竛微生物發(fā)酵：最大量的來源n化學(xué)及生物合成：生物重組高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎酶提取酶提取酶分離純化酶分離純化酶濃縮酶濃縮酶貯存酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液（胞外酶）發(fā)酵液（胞外

2、酶）離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。取分離，結(jié)晶分離等。1.2 集中壟斷，市場全球化：集中壟斷，市場全球化：規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）1978年進(jìn)入中國諾維信公司，占50%市場（兼并天津酶制劑廠）；美國杰能科公司（Genencor）98年進(jìn)入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并。帝斯曼（DSM），巴斯

3、夫(BSF)Pfizer，Rhone，SKW , Biosystems，日本天野1.3 品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。我國2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。國際以液體、顆粒為主。國內(nèi)糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，顯然不合理。重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚未投入生產(chǎn);我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。1.4 應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大：美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。非食

4、品工業(yè)用酶市場份額逐漸擴(kuò)大。2 酶的發(fā)酵技術(shù)酶的發(fā)酵技術(shù)利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：n(1) 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。n(2) 微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。n(3) 微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜。n(4) 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，沒有季節(jié)性，經(jīng)濟(jì)效益高。n(5) 可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。2.1 微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的步驟微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的步驟目的酶生產(chǎn)菌株目的酶生產(chǎn)菌株的分離篩選的分離篩選（1）從自然界分離篩選）從

5、自然界分離篩選（2）用物理、化學(xué)因子處理誘變）用物理、化學(xué)因子處理誘變（3）用基因重組或細(xì)胞融合技術(shù)選育）用基因重組或細(xì)胞融合技術(shù)選育酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)要選擇好的培養(yǎng)方法，包括：要選擇好的培養(yǎng)方法，包括：（1）培養(yǎng)基組成配比）培養(yǎng)基組成配比（2）培養(yǎng)條件如溫度、）培養(yǎng)條件如溫度、pH 值、通氣量等。值、通氣量等。2.2產(chǎn)酶微生物產(chǎn)酶微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，經(jīng)過篩選用在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶的微生物有50-60種，目前在酶的生產(chǎn)中，絕大多數(shù)的微生物酶僅由25種左右的微生物來生產(chǎn)的。其中霉菌家族占了

6、12種，如青霉、黑曲霉、米曲霉，其次是枯草芽孢桿菌，被稱為是最有用的產(chǎn)酶微生物。2.3 培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇重要培養(yǎng)基培養(yǎng)基氮源氮源碳氮比碳源碳源生長生長因子因子產(chǎn)酶產(chǎn)酶促進(jìn)劑促進(jìn)劑無機(jī)無機(jī)鹽鹽123456（1）碳源w碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。重要w有機(jī)碳的主要來源有：n一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；n二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中1216碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂

7、酶，均已獲得成功。n不同的細(xì)胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。n例如，淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。重要（2）氮源n氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種。n常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨

8、基酸等；n無機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。重要n不同的細(xì)胞對各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來說，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量僅為有胨時(shí)的30%。只用有機(jī)氮源而不用無機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%3%的無機(jī)氮源。重要（3） 碳氮比n在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。n一般蛋白酶 (包括酸性、中性和堿性蛋

9、白酶) 生產(chǎn)采用碳氮比低碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75 %、玉米粉0.625%、魚粉0.625%。NH4Cl 1%、CaCl2 0.5%、Na2HPO4 0.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)基； 重要n淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4 %、玉米粉8 %、Na2HPO4 0.8%、 (NH4)2SO4 0.4%、CaCl2 0.2%組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但

10、是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。重要（4） 無機(jī)鹽n微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。重要n鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時(shí)灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)穩(wěn)定pH范圍可以擴(kuò)大到57。鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時(shí)以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。n在天然培養(yǎng)基中，一般

11、微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時(shí)，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%80%。（5）生長因子 n微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素32128mg / mL。重要（6） 產(chǎn)酶促進(jìn)劑 n產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面

12、活性劑。一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫80的濃度為0.1 %時(shí)能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對人、畜無害。此外各種產(chǎn)酶促進(jìn)劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。重要2.4 液體深層發(fā)酵的工藝控制液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(1) 溫度對產(chǎn)酶的

13、影響溫度對產(chǎn)酶的影響 n發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)成分來合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時(shí)的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時(shí)的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。n發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時(shí)，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。n微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37 ，霉菌和放線菌為2830 ，一些

14、嗜熱微生物需在4050 下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度3537，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為3740 。n在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度必須從31 逐漸升溫至40 ，然后再降溫到31進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報(bào)道，酶生產(chǎn)的溫度對酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶生產(chǎn)時(shí)，在55 培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35 好。(2) pH對產(chǎn)酶的影響對產(chǎn)酶的影響n種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH

15、有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。n一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對產(chǎn)酶帶來不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C / N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時(shí)用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時(shí)，通過氮調(diào)節(jié)。(3) 通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響n其實(shí)通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵

16、初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風(fēng)量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時(shí)，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時(shí)期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動(dòng)測定和記錄溶解氧的儀表。(4) 攪拌的影響攪拌的影響n對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從

17、而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時(shí)攪拌也帶來一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。(5) 泡沫的影響泡沫的影響n發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時(shí)泡沫過多影響補(bǔ)料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產(chǎn)上必須采用消泡措施。一般除了機(jī)械消泡外，還可利用消泡劑。n消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其表面相互作

18、用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。(6) 濕度濕度n用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時(shí)，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。3 酶的分離純化酶的分離純化酶的分離純化工作，是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。酶的純化過程，就目前而言，還是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)。一個(gè)特定酶的提純往往需要通過許多次小實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，沒有通用的規(guī)律可循。酶原料的選擇選擇組織組織破碎（胞外酶除外）溶劑劑抽提后離心分離 進(jìn)進(jìn)一步純純化3.1 酶原料的選擇酶原料的選擇一般來說，為了使純化過程容易進(jìn)行，總是選擇目的酶含量最多的生物組織為原料來進(jìn)行提取純化的。當(dāng)然，也要考慮原料的來源、取材方便、經(jīng)濟(jì)等因素。在分離純化動(dòng)物

19、Cu，ZnSOD(超氧化物歧化酶)時(shí)，一般就以含Cu，ZnSOD很高的動(dòng)物血球?yàn)樵牧?。MnSOD主要存在于線粒體中，所以，龍蝦、靈芝草、人體組織適宜于作為提取MnSOD的原材料。但龍蝦、靈芝草等非常昂貴，人體組織也很難得到，因而，除非是特殊目的的純化，一般不選用這些材料提取酶。3.2 生物組織的破碎生物組織的破碎各種生物組織的細(xì)胞有著不同的特點(diǎn)，各種生物組織的細(xì)胞有著不同的特點(diǎn)，在考慮破碎方法時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)、在考慮破碎方法時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)、處理量及酶的性質(zhì)，采用合適的方法。處理量及酶的性質(zhì)，采用合適的方法。機(jī)械破碎機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切

20、力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。物理破碎物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎?；瘜W(xué)破碎化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破

21、碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理酶的抽提液酶的抽提液為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。典型的抽提液由以下幾部分組成：抽提液 離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑 十 pH緩沖劑 溫度效應(yīng)劑(KCl、NaCl、蔗糖) (各種緩沖液) (甘油、二甲基亞砜) 蛋白酶抑制劑 防氧化劑 重金屬絡(luò)合劑 增溶劑 (PM3F、DIFP) (DTT 巰基乙醇) (EDTA、檸檬酸) (TritonX100)根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。(1) 鹽溶液提取鹽溶液提取

22、n0.020.5mol/L的鹽溶液，用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶。大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。 (2) 酸溶液提取酸溶液提取npH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶。例如從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12 mol/L的硫酸溶液進(jìn)行提取。(3) 堿溶液提取堿溶液提取npH812的水溶液，用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶。例如，細(xì)菌L天門冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH 1112.5的堿溶液中，振蕩20 min，即達(dá)到顯著的提取效果。(4) 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑

23、提取n有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇對脂蛋白的解離能力較強(qiáng)，提取效果較好，已成功地用于琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、膽堿酯酶等的提取。3.3 離心分離離心分離離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)，在酶的提取和分離純化過程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。在離心過程中，應(yīng)該根據(jù)需要，選擇

24、好離心力(或離心速度) 和離心時(shí)間，并且控制好溫度和pH值等條件。3.4 酶的純化酶的純化抽提的酶液是否需要進(jìn)一步經(jīng)過純化，要視其應(yīng)用部門的要求。一般工業(yè)的酶，如紡織工業(yè)應(yīng)用淀粉酶脫膠處理，往往采用液體粗酶便可；皮革工業(yè)應(yīng)用的細(xì)菌蛋白酶也是如此。食品工業(yè)應(yīng)用的酶如果粗酶液已達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)要求，特別是衛(wèi)生指標(biāo)，也無需進(jìn)一步純化。然而，應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)試劑級的酶液必須進(jìn)一步純化。在濃縮液或發(fā)酵液中，除含有我們需要的酶以外，還不可避免地存在著其他大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)。其中小分子物質(zhì)在以后的純化步驟中會(huì)自然而然的除去。大分子物質(zhì)中包括核酸、粘多糖及其他蛋白質(zhì)等。因此，酶的分離純因此，酶的分離純化工作

25、主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去。酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體有以下幾個(gè)方面，它們的分離方法根據(jù)這個(gè)基礎(chǔ)分為：n(1) 根據(jù)分子大小而設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。n(2) 根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。n(3) 按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。n(4) 按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇

26、性表面變性法等。n(5) 按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的純化方法：酶的純化方法：重要有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用和水互溶的有機(jī)溶劑使酶沉淀的方法很早就用來純化酶。在工業(yè)上也很重要，例如血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍采用本法。由于本法的機(jī)理和鹽析法不同，可作為鹽析法的補(bǔ)充。加入有機(jī)溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對酶分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在憎水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了

27、憎水性特別強(qiáng)的酶外，對多數(shù)酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品級酶。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)：容易使酶變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。膜過濾分離法膜過濾分離法過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用

28、。屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 過濾的分類及其特性過濾的分類及其特性( (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) ) 類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾粗濾 2m酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾微濾0.22m細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾超濾200.2m病毒、生物大分子等超濾膜反滲反滲透透 20生物小分子、鹽、離子 反滲透膜凝膠過濾凝

29、膠過濾(gel filtration chromatography)凝膠過濾有多種名稱，又稱凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠層析法等。是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的方法。它具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：操作方便，不會(huì)使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)使用等；因而在酶純化中占有重要位置。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質(zhì)的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應(yīng)用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級分離以及分子量測定等。圖圖24 凝膠過濾層析的原理凝膠過濾層析的原理a.小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。外，在顆粒間迅速通過。b. 1.蛋白質(zhì)混合物上柱，蛋白質(zhì)混合物上柱，2. 洗脫開始