結(jié)核分支桿菌katG蛋白的高表達(dá)與純化

1、    關(guān)鍵詞：分支桿菌結(jié)核；katG；基因表達(dá)；蛋白純化 【摘要】目的表達(dá)與純化結(jié)核分支桿菌katG蛋白，為深入研究異煙肼耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)，分別對不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色。獲得穩(wěn)定的高表達(dá)菌株后采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)對超聲破菌液進(jìn)行純化。最后對純化產(chǎn)物進(jìn)行過氧化氫酶活性的初步檢測。結(jié)果對誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌菌液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以

2、及考馬斯亮藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量約為80000。表達(dá)蛋白量約占總蛋白量的17.7%。對重組katG基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以350mmol/L咪唑洗脫時(shí)的純化效果最理想，蛋白純度可達(dá)90%以上。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行過氧化氫酶活性初步檢測證明，重組的katG基因產(chǎn)物具有過氧化氫酶活性。HTH結(jié)論通過pET24b-katG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得基因重組的katG高表達(dá)菌株，表達(dá)產(chǎn)物具有一定酶活性，經(jīng)純化后可達(dá)到較高的純度。 Overexpressionandpurificationofcatalase-peroxidasekatGfrommycobacteriumtuberculosis

3、【Abstract】ObjectiveToexpressandpurifythecatalase-peroxidasekatGgenefrommycobacteriumtuberculosis.MethodsPlasmidpET24bcontainingkatGwastransferredintocompetentEscherichiacoliandkatGgenewasoverexpressedbythechallengeofisopropylthio-D-glactoside(IPTG).TheexpressionofkatGproteinwasone-steppurifiedbyXpre

4、sssystemTM.Furthermore,thecatalaseactivityofkatGproteinwaspreliminarilydetected.ResultsTherecombinantescherichiacoliproducedkatGproteininlargequantities,accountingfor17.7%oftotalcellprotein.ThemolecularmassofkatGproteinwasestimatedtobe80000bysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegradientgelelectrophres

5、is(SDS-PAGE).Itwasfoundthatimidazoleattheconcentrationof350mmol/LcouldelutethekatGproteinmostefficientlyandyieldthefinalpreparationatgreaterthan90%purity.ThekatGproteinwaspreliminarilydetectedtohavetheactivityofcatalase.ConclusionsThestablekatGoverexpressingrecombinantEscherichiacolicanbeconstructed

6、bytheplasmidpET24bcontainingkatGgene.TherecombinantstraincanproducekatGproteinwithcatalaseactivityandtheproductofwhichcanbepurifiedintohigheractivity. 【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;katG;Geneexpression;Proteinpurification 異煙肼(INH)是一種最經(jīng)濟(jì)有效的抗癆藥，幾乎所有的抗癆方案中均包括INH。結(jié)核分支桿菌編碼的katG基因的突變可致結(jié)核分支桿菌對INH產(chǎn)生耐藥性

7、。自1992年以來，對于katG基因變異或缺失造成分支桿菌對異煙肼耐藥的基因水平研究已較為深入1，2，有必要在蛋白水平對耐藥機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化埃希大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得穩(wěn)定的高表達(dá)菌株后進(jìn)一步對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行了酶活性的初步檢測。 材料與方法 一、材料 (一)質(zhì)粒與菌株表達(dá)質(zhì)粒pET24b-katG與埃希大腸桿菌BL21(DE3)由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所惠贈(zèng)。 (二)試劑XpressTM蛋白純化系統(tǒng)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；異丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)為華美生物工程公司產(chǎn)品；其他主要生

8、化試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品或國內(nèi)AR級產(chǎn)品。 二、方法 (一)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化與基因產(chǎn)物的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pET24b-katG轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理法得到的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，將菌株涂于含卡那霉素的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)。挑取抗卡那霉素的菌株接種于20ml的LB培養(yǎng)基(加入20%的葡萄糖0.2ml，濃度50mg/ml的卡那霉素40l,濃度20mg/ml的氯霉素34l)中，37°C，160r/min振搖過夜。取3ml過夜培養(yǎng)物種入100ml的LB培養(yǎng)基(含20%的葡萄糖1ml，濃度10mg/ml的卡那霉素400l，濃度20mg/ml的氯霉素170l)中，3

9、7°C以160r/min振搖，每20min測定1次A600值，直至A600值到達(dá)0.40.5(勿超過0.5)。隨后每100mlLB培養(yǎng)基中加入1mol/LIPTG400l，分別在加入IPTG后的第2、3、4、5、6h收集菌液。將菌液在4°C下，5000g，離心5min，棄上清。將沉淀物以10ml緩沖液(50mmol/LTris.Cl,pH8.0,2mmol/LEDTA,0.1%TritonX-100)重新懸浮，加入溶菌酶(100g/ml)。在冰浴中以中等強(qiáng)度超聲破菌，每次10s，共3次，破菌后，4°C，離心5min，收集上清液備用。 (二)表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉

10、-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測參照文獻(xiàn)進(jìn)行。收集IPTG誘導(dǎo)后的菌液10l，與加樣液10l混合，100°C水浴，3min后點(diǎn)樣，25mA恒流通電進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后以考馬斯亮藍(lán)染色15min，然后以脫色液脫色觀察結(jié)果。 (三)表達(dá)產(chǎn)物的純化采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。用無菌雙蒸水懸浮樹脂純化柱3次。加入7ml結(jié)合液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉，pH7.8)，以及經(jīng)IPTG不同時(shí)間誘導(dǎo)后產(chǎn)量最高的破菌液上清5ml，重新懸浮純化柱。反復(fù)輕搖混合2min。靜置10min，吸棄上清，再加入破菌液上清5ml重復(fù)以上步驟。以4ml結(jié)合液重

11、新懸浮純化柱，溫和搖動(dòng)混合2min，靜置沉淀，吸棄上清，共3次。再以沖洗緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉，pH6.0)洗4次，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、200、350、500mmol/L)各5ml加入柱中，收集不同洗脫濃度的洗脫液。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。將純化后的蛋白以85%的硫酸胺沉淀，離心后將沉淀物以無菌雙蒸水溶解，4°C透析過夜。透析產(chǎn)物加入甘油(40%)后貯藏于-80°C的環(huán)境下。 (四)過氧化氫酶活性測定對破菌液上清進(jìn)行過氧化氫酶活性的初步測定。用磷酸鹽(K2HPO4+KH2PO4,0.1mol/L)與NaCl(2mol/L

12、)的緩沖液配制10%的Tween80溶液，取5ml與30%的雙氧水5ml混合。分對照管與katG管，在katG管內(nèi)加入不同容積的含pET-katG表達(dá)質(zhì)粒的菌株破菌上清(20、40、80、160l)，對照管則加入含pET空載體的菌株破菌上清，10min后觀察氣泡產(chǎn)生情況。如產(chǎn)生大量氣泡則提示酶活性較佳。 結(jié)果 一、重組katG蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及產(chǎn)物的鑒定分析 將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，分別對不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色，可在相對分子質(zhì)量80000處見一誘導(dǎo)表達(dá)帶(圖1)。比較不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)2h后的表達(dá)產(chǎn)量已達(dá)到峰值。在其后蛋白純化中即可選取該誘導(dǎo)時(shí)間的產(chǎn)物。對此誘導(dǎo)表達(dá)帶進(jìn)行黑度密度自動(dòng)掃描分析，此處表達(dá)蛋白量約占總菌體蛋白量的17.7%。 二、重組katG基因表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果 采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化發(fā)現(xiàn)，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、200、350、500mmol/L)洗脫純化柱后，所收集的洗脫液再次進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以350mmol/L咪唑洗脫后純化的效率最高，通過SDS-PAGE黑度密度自動(dòng)掃描分析可以發(fā)現(xiàn)純