第二十四章疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究ppt課件

1、第二十四章第二十四章 疾病相關(guān)基因的鑒定與基因疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研討功能研討疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，由于疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，由于幾乎一切的疾病都與基因構(gòu)造或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳幾乎一切的疾病都與基因構(gòu)造或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳要素和環(huán)境要素相互作用的結(jié)果。要素和環(huán)境要素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因疾病相關(guān)基因 致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因構(gòu)造或表達(dá)的異常的因果關(guān)系，即該基因構(gòu)造或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接緣由是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接緣由 疾病易感基因：環(huán)境要素

2、和遺傳要素均起著一定作用，疾病易感基因：環(huán)境要素和遺傳要素均起著一定作用，表現(xiàn)為表現(xiàn)為2個(gè)以上基因的個(gè)以上基因的“微效作用的相微效作用的相加，或者多基因間的相互作用，而單一加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅添加對(duì)疾病的易感性基因變異僅添加對(duì)疾病的易感性第一節(jié)第一節(jié) 鑒定疾病相關(guān)基因的原鑒定疾病相關(guān)基因的原那么那么 一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的本質(zhì)聯(lián)絡(luò)疾病表型和基因間的本質(zhì)聯(lián)絡(luò)正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件 確定疾病的遺傳要素，即經(jīng)過孿生子分析，確定疾病的遺傳要素，即經(jīng)過孿生子分析，領(lǐng)營(yíng)養(yǎng)析和同

3、胞罹患率分析等確定遺傳要素領(lǐng)營(yíng)養(yǎng)析和同胞罹患率分析等確定遺傳要素能否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。能否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。 二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需求多學(xué)科二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需求多學(xué)科多途徑的綜合戰(zhàn)略多途徑的綜合戰(zhàn)略疾病相關(guān)基因鑒定克隆戰(zhàn)略表示圖疾病相關(guān)基因鑒定克隆戰(zhàn)略表示圖 三、確定候選基因是多種克隆疾病三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)可以到達(dá)最終鑒定疾病相關(guān)基有許多途經(jīng)可以到達(dá)最終鑒定疾病相關(guān)基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因一旦候選

4、基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的戰(zhàn)略依然是首先找出候選予以鑒定，但常用的戰(zhàn)略依然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。 第二節(jié)第二節(jié) 疾病相關(guān)基因克隆的戰(zhàn)略和疾病相關(guān)基因克隆的戰(zhàn)略和方法方法一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆戰(zhàn)略因克隆戰(zhàn)略 不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆戰(zhàn)略包括功能克隆、表型克隆及采用位點(diǎn)非依賴的DNA序列信息和動(dòng)物模型來鑒定和克隆疾病基因。一從知蛋白質(zhì)的功能和構(gòu)造出發(fā)克隆一從知蛋白質(zhì)的

5、功能和構(gòu)造出發(fā)克隆疾病基因疾病基因功能克隆功能克隆functional cloningfunctional cloning采用的是從采用的是從蛋白質(zhì)到蛋白質(zhì)到DNADNA的研討道路，針對(duì)的是一些對(duì)影的研討道路，針對(duì)的是一些對(duì)影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病 1 1根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因 2 2用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因 二從疾病的表型差別出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相二從疾病的表型差別出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因關(guān)基因表型克隆表型克隆phenotype cloning基于對(duì)

6、疾病基于對(duì)疾病表型和基因構(gòu)造或基因表達(dá)的特征聯(lián)絡(luò)曾經(jīng)有所表型和基因構(gòu)造或基因表達(dá)的特征聯(lián)絡(luò)曾經(jīng)有所認(rèn)識(shí)的根底上來分別鑒定疾病相關(guān)基因認(rèn)識(shí)的根底上來分別鑒定疾病相關(guān)基因 1. 從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對(duì)產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)展克隆，而不需求基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。 2. 針對(duì)知基因。假設(shè)高度疑心某種疾病是由于某個(gè)特殊的知基因所致，可經(jīng)過比較患者和正常對(duì)照間該基因表達(dá)的差別來確定該基因能否為該疾病相關(guān)基因。 3. 針對(duì)未知基因的，可經(jīng)過比較疾病和正常組織中的一切mRNA的表達(dá)種類和含量間的差別，從而克隆疾病相關(guān)基因。這種差別能夠源于基因構(gòu)

7、造改動(dòng)，也能夠源于表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改動(dòng)。根據(jù)根據(jù)DNA或或mRNA的改動(dòng)與疾病表型的關(guān)的改動(dòng)與疾病表型的關(guān)系，可有幾種戰(zhàn)略：系，可有幾種戰(zhàn)略： 針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差別顯示差別顯示mRNA differential display，mRNA-DD抑制消減雜交抑制消減雜交suppressive substractive hybridization，SSH 基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析SAGE cDNA微陣列微陣列 cDNA microarray 基因鑒定集成法基因鑒定集成法 integrated procedure for gene identificati

8、on RDA技術(shù)原理和根本過程表示圖技術(shù)原理和根本過程表示圖mRNA-DD技術(shù)原理和根本過程表示圖技術(shù)原理和根本過程表示圖 三采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因三采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類的部分疾病，曾經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。人類的部分疾病，曾經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。假設(shè)動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的假設(shè)動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位某一部位, 而具有類似人類疾病表型的基因很而具有類似人類疾病表型的基因很有能夠存在于人染色體的同源部位。有能夠存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來定位分他

9、人的定，還可以采用熒光原位雜交來定位分他人的同源基因。同源基因。 二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法經(jīng)典方法定位克隆定位克隆positional cloning：僅根：僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關(guān)基因。克隆疾病相關(guān)基因。定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，運(yùn)用據(jù)這一位置信息，運(yùn)用DNA標(biāo)志將經(jīng)典的標(biāo)志將經(jīng)典的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)志所代表的特定遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)志所代表的特定基因

10、組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連基因組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連重疊群重疊群 contig 挑選候選基因，最后比挑選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差別，確定基較患者和正常人這些基因的差別，確定基因和疾病的關(guān)系。因和疾病的關(guān)系。一基因定位的方法一基因定位的方法1體細(xì)胞雜交法經(jīng)過交融細(xì)胞的篩查定位基因體細(xì)胞雜交法經(jīng)過交融細(xì)胞的篩查定位基因 2染色體原位雜交是在細(xì)胞程度定位基因的常用方法染色體原位雜交是在細(xì)胞程度定位基因的常用方法3. 染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法 4連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法連鎖分析是定位疾病未知基因的

11、常用方法二定位克隆的根本程序包括三大步驟二定位克隆的根本程序包括三大步驟1盡能夠減少染色體上的候選區(qū)域盡能夠減少染色體上的候選區(qū)域2構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜3. 疾病相關(guān)基因確實(shí)定疾病相關(guān)基因確實(shí)定三假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是三假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的勝利例證定位克隆的勝利例證首先，根據(jù)患病女性首先，根據(jù)患病女性X染色體與第染色體與第21號(hào)常染色體的易號(hào)常染色體的易位，以及男患兒發(fā)生小的位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他缺失并伴發(fā)三種其他X連連鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用RFLP連鎖分析將連鎖分析將DMD基因定位于基因定位于

12、Xp21。然后，分別克隆得到了基因的然后，分別克隆得到了基因的2個(gè)不同的片段，分別個(gè)不同的片段，分別命名為命名為XJ系列探針和系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明較，證明DMD基因約為基因約為2300 kb，占，占X染色體的染色體的1%以上，以上，該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白dystrophin，影響橫紋肌，影響橫紋肌和心肌的構(gòu)造和收縮功能。和心肌的構(gòu)造和收縮功能。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良DMD三、確定常見病的基因需求全基因三、確定常見病的基因需求全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因組的關(guān)聯(lián)研討全

13、基因組的關(guān)聯(lián)研討genome-wide association study, GWAS全外顯子測(cè)序全外顯子測(cè)序whole exon sequencing四、生物信息數(shù)據(jù)庫貯藏豐富的疾病相四、生物信息數(shù)據(jù)庫貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息關(guān)基因信息人類基因組方案和多種方式生物基因組測(cè)人類基因組方案和多種方式生物基因組測(cè)序的完成序的完成, 生物信息學(xué)的開展生物信息學(xué)的開展, 計(jì)算機(jī)軟件的開計(jì)算機(jī)軟件的開發(fā)運(yùn)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們經(jīng)過已獲得的序發(fā)運(yùn)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們經(jīng)過已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)展同源列與數(shù)據(jù)庫中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)展同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫中不同物種間的序列比較性比

14、較，或?qū)?shù)據(jù)庫中不同物種間的序列比較分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而經(jīng)過分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是實(shí)驗(yàn)證明，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克隆所謂的電子克隆 in silico cloning。 第三節(jié)第三節(jié) 疾病相關(guān)基因的功能研討疾病相關(guān)基因的功能研討基因的功能實(shí)踐是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的功能實(shí)踐是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是的功能，前者是本節(jié)討論的重點(diǎn)。本節(jié)討論的重點(diǎn)?；虍a(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個(gè)不同程度來描畫：基因產(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功

15、能可以從三個(gè)不同程度來描畫： 生物化學(xué)程度，主要描畫基因產(chǎn)物參與了何種生化過生物化學(xué)程度，主要描畫基因產(chǎn)物參與了何種生化過程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等；程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等； 細(xì)胞程度細(xì)胞程度, 主要論述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位和參與的主要論述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位和參與的生物學(xué)途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與生物學(xué)途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與DNA的修復(fù)過程，有能夠并不了解確切的生物化學(xué)功能；的修復(fù)過程，有能夠并不了解確切的生物化學(xué)功能； 整體程度整體程度, 主要包括基團(tuán)表達(dá)的時(shí)空性及基因在疾病中主要包括基團(tuán)表達(dá)的時(shí)空性及基因在疾病中的作用。的作用。一、基因比對(duì)及功能詮釋一、基

16、因比對(duì)及功能詮釋 常用的兩大雙序列比對(duì)工具是常用的兩大雙序列比對(duì)工具是BLAST和和FASTA,分別由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心分別由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI和歐洲生物信息學(xué)研討所和歐洲生物信息學(xué)研討所EBI開發(fā)和維護(hù)。開發(fā)和維護(hù)。NCBI的主頁是的主頁是/；EBI的主頁是的主頁是ebi.ac.uk/。 二、利用工程細(xì)胞研討基因功能二、利用工程細(xì)胞研討基因功能 一采用基因重組技術(shù)建立基因高表達(dá)工一采用基因重組技術(shù)建立基因高表達(dá)工程細(xì)胞系程細(xì)胞系二基因沉默技術(shù)抑制特異基因的表達(dá)二基因沉默技術(shù)抑制特異基因的表達(dá) 三、研討生物大分子間的相互作用可確三、研討生物大分子間的相互作用可確定基因功能定基因功能 在一些情況下在一些情況下, 即使對(duì)基因的序列、構(gòu)造和表達(dá)方式有即使對(duì)基因的序列、構(gòu)造和表達(dá)方式有清楚的認(rèn)識(shí)，但依然難以闡明基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。清楚的認(rèn)識(shí)，但依然難以闡明基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。此時(shí)經(jīng)過研討該蛋白質(zhì)與知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無疑將此時(shí)經(jīng)過研討該蛋白質(zhì)與知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無疑將非常有助于對(duì)該蛋白質(zhì)功能的了解。非常有助于對(duì)該蛋白質(zhì)功能的了解。 常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜交技術(shù)見第二十章和噬菌體展現(xiàn)技術(shù)。交技術(shù)見第二十章和噬菌體展現(xiàn)技術(shù)。 四、利用基因修飾動(dòng)