細胞培養(yǎng)基本技術(shù)(58)

1、細胞培養(yǎng)基本技術(shù)細胞培養(yǎng)的甚本概念n 傳代：傳代：n 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。n 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)n 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。n n細胞培養(yǎng)：使用單個細胞懸液n組織培養(yǎng)：使用組織塊（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）n器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個器宮原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿n原代培養(yǎng)期n傳代期n衰退期n有限細胞系，無限細胞系 n細胞系 cell linen細胞株 cell strain 培養(yǎng)細胞的特性n 培養(yǎng)細胞的生長方式n貼附生長：n 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞n懸浮生長：

2、n 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞 每代貼附生長細胞的生長過程n游離期n貼壁期n潛伏期n對數(shù)生長期n停止期（平臺期）n游離期：n細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。n10分鐘一4小時n貼壁期：n細胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。n底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等n血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。n進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）n潛伏期n此時細胞有生

3、長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期 一般為624小時。n對數(shù)生長期：n細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。n停止期（平臺期）：n細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂n機制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細胞生長的條件n1 細胞的營養(yǎng)需要n2 細胞的生存環(huán)境n 溫度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH: 7.2-7.4n 滲透壓n 3 無污染n 4 無毒 實驗準備實驗用品：實驗用品：n超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸nCO2培養(yǎng)箱n倒置顯微鏡n酶標儀、微孔板震蕩器n液氮罐n自動雙重純水蒸餾器，純水儀n耗

4、材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管n壓力蒸汽消毒器：壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣n電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃n器皿消毒 n濾器：濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 n酶液等均采用濾過法除菌 n超凈工作臺：超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境n紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料n培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 超凈臺n n超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 濾 器 CO2培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定

5、的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：n 用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動雙重純水蒸餾器 純水儀酶標儀 微孔板震蕩器培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶 n浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、小時）、n流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干烘干n常用玻璃器皿清洗 清潔液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：Na

6、Cl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 細胞培養(yǎng)用液的配制n胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離n胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。n胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。n胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。n用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用 消化液：培養(yǎng)基n培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。n天然培養(yǎng)基天然培

7、養(yǎng)基：n天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。n優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好n缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染 n合成培養(yǎng)基:n合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。n優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 n缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。 n人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定

8、量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 n血清中含有：n多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）n多種金屬離子； n激素；n促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。n各種生長因子n轉(zhuǎn)移蛋白n不明成分n一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般需加 10血清n對于血清支持細因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚n血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。n在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞n無血清培

9、養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。n無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。n1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。n無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。n向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。

10、目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清 n血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。n常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。n血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘n血清的消毒：過濾除菌n抗菌素的使用：n在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。n通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。n慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成n基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95n血清 5一20n碳酸氫鈉 2.0 g/

11、Ln青、鏈霉素 各100卑位毫升培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10） 細胞傳代方法n 根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代n 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。n 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2 半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）n此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。

12、3貼壁生長細胞傳代n 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長細胞傳代方法：n1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液n2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。n3. 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。n4. 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。n5. 吸取1/101/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。n6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。n7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞計數(shù)n血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞nCoulter計數(shù)儀：人工計數(shù)培養(yǎng)細胞活力測定n細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)

13、用最廣的技術(shù)手段之一。 n任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。n1. 細胞克隆形成率實驗： 單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯毎脑鲋衬芰Α?n克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細胞數(shù)n缺點：操作繁瑣n優(yōu)點：精確、可靠n2.臺盼藍法n活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞恬力 n已淘汰n3. 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍，n四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲

14、亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值nMTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。n操作步驟n（1）單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5nCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。n（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。n（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢

15、測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制細胞凍存和復(fù)蘇n細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融n當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。n n 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序n標準程序：n 當溫度在-25 以上時， 12 /minn 當溫度達-25 以下時， 510 /minn 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中n 細胞凍存器n簡易程序：n 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護劑的應(yīng)用n在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。n常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存方法n1預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DMSO