壓力對牛眼小梁細胞誘導型一氧化氮合酶mRNA的表達及蛋白質(zhì)合

1、    壓力對牛眼小梁細胞誘導型一氧化氮合酶 mRNA的表達及蛋白質(zhì)合成的影響        【摘要】目的研究牛眼小梁細胞中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在不同壓力下的mRNA表達及蛋白質(zhì)合成的變化，探討一氧化氮（nitric oxide，NO）在青光眼發(fā)病中的作用。方法培養(yǎng)新生牛眼小梁細胞，并分別給予20、40、60及80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)的壓力，以不加壓組為對照組，用

2、原位雜交和還原型輔酶硫辛酰胺脫氫酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)組織化學染色技術對小梁細胞iNOS的mRNA和蛋白質(zhì)含量變化進行定性及定量觀察。結果牛眼小梁細胞中iNOS mRNA 及蛋白質(zhì)含量均隨壓力增高而增高。對照組與壓力20 mm Hg組比較，兩組iNOS mRNA均為弱表達，組間差異無顯著性(t=0.950 1,P>0.05)；壓力40 mm Hg和60 mm Hg組與對照組相比差異有顯著性(t值分別為0.038 1和0.032 4,P<0.05)；壓力80 mm Hg組與對照組相比差異有非常顯著性(

3、t=0.000 16,P<0.01)；壓力40 mm Hg組與60 mm Hg組相比，組間差異無顯著性(t=0.112 3,P>0.05)，而與80 mm Hg組相比差異有非常顯著性(t值分別為0.002 9和0.004 5,P<0.01)。NADPH組織化學染色結果與原位雜交結果基本相同，僅顯示40 mm Hg組與60 mm Hg組的組間差異有顯著性(t=0.042 0,P<0.05)。結論壓力可激活iNOS mRNA表達，由此產(chǎn)生過量的NO可損傷小梁細胞，成為導致或加重青光眼的因素之一。【關鍵詞】小梁網(wǎng)；一氧化氮；原位雜交；免疫組織化學Pressure influe

4、nce on mRNA expression and protein synthesis of inducible nitric oxide synthetase in bovine trabecular meshwork cellXUE Wei, DU Shuhua, LI Yong, et al.Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China【Abstract】ObjectiveTo investigate the inducible nitric ox

5、ide synthetase (iNOS) mRNA expression and protein synthesis in bovine trabecular meshwork cell and discuss the possible effects of nitric oxide (NO) in the development of glaucoma. Methods20 mm Hg, 40 mm Hg, 60 mm Hg and 80 mm Hg pressure were respectively added on cultured trabecular cells of new b

6、orn bovine. No pressure group was set as the control. The changes of iNOS mRNA and protein in trabecular meshwork cells under different pressures were demonstrated qualitatively and quantitatively by in situ hybridization and nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPH-d) histochem

7、ical assay. ResultsThe expression of iNOS mRNA and its protein synthesis became higher and higher as the pressure was increased. There was weak iNOS mRNA expression in the control and 20 mm Hg groups, and no significant difference between them. 40 mm Hg and 60 mm Hg groups had a statistical differen

8、ce from the control group. And 80 mm Hg group had a very significant difference from the control group There was no difference between 40mm Hg and 60 mm Hg groups, but they had significant difference from 80 mm Hg group. NADPH-d histochemical assay showed almost the same results except that there wa

9、s significant difference between 40 mm Hg and 60 mm Hg groups. ConclusionsPressure can evoke the expression of iNOS mRNA, and the nitric oxide thus produced can be one of the causes of trabecular meshwork destruction, that may induce or aggravate glaucoma.【Key words】Trabecular meshwork；Nitric oxide

10、synthetase；In situ hybridization；Immunohistochemistry一氧化氮（nitric oxide, NO）是近年來受到廣泛重視的小分子物質(zhì)，人們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，它具有十分復雜的雙重性，既是不可缺少的神經(jīng)遞質(zhì)、免疫活性物質(zhì)，又具有細胞毒性作用。NO在眼球內(nèi)廣泛分布并參與多種病理生理過程。以往的青光眼研究結果提示在不抑制房水生成的情況下，NO能改善房水流暢系數(shù)，以降低眼壓；NO神經(jīng)元廣泛分布于房角及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層，而青光眼患者小梁網(wǎng)和睫狀體處的NO神經(jīng)纖維比正常人明顯減少；NO可通過多種途徑，如增加自由基和細胞內(nèi)Ca2+濃度，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞產(chǎn)生直

11、接毒性作用。因此，我們以體外培養(yǎng)的牛眼小梁細胞為模型，用原位雜交及組織化學染色方法，研究壓力對誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）mRNA的表達及蛋白質(zhì)合成的影響，并初步探討其與青光眼發(fā)病的關系。材料與方法一、小梁細胞的培養(yǎng)新生小牛宰殺后立即取出眼球，在6 h內(nèi)按王林等1及Hernandez等2的培養(yǎng)方法進行小梁細胞培養(yǎng)。于角膜后緣5 mm處環(huán)形剪開眼球，去除玻璃體、晶狀體及葡萄膜，在解剖顯微鏡下找到小梁網(wǎng)，用眼科鑷順其方向撕下海綿狀小梁網(wǎng)(撕下小梁網(wǎng)后，在角鞏膜交界處可見位置很淺的鞏膜內(nèi)溝)，將小梁網(wǎng)剪成細小的碎塊，放入含20小牛血

12、清的RPIM-1640培養(yǎng)基中進行小梁細胞培養(yǎng)。將第35代細胞消化后，傳代于鋪滿小蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，待細胞長滿80后，用于制備高眼壓模型。二、波形蛋白免疫組化染色一抗為小鼠抗人和小鼠抗動物波形蛋白多克隆抗體，二抗為與生物素結合的兔抗小鼠抗體，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。免疫組化染色的主要操作步驟：用3 H2O2室溫孵育培養(yǎng)的小梁細胞510 min，以滅活細胞中內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。復合消化酶消化510 min后，再用蒸餾水洗3次，滴加正常小牛血清封閉液，室溫放置20 min。滴加1100稀釋的特異性一抗工作液，37下孵育3060 min或4下過夜。PBS洗3次后，滴加生物素標記的二抗

13、工作液，37下孵育20 min。DAB(dimethylaminoazobenzene)室溫顯色。最后以酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。三、高眼壓模型密閉培養(yǎng)瓶，用空針從培養(yǎng)瓶塞中注入無菌空氣加壓，同時從與培養(yǎng)瓶相通的壓力表中直接讀取壓力值。壓力分別為20、40、60及80 mm Hg。在37恒溫下培養(yǎng)24 h。四、原位雜交iNOS探針購自德國Beohringer Mannheim公司。探針的標記和檢測按地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明書進行。主要操作步驟：細胞標本用4多聚甲醛固定后，依次用PBS浸洗、0.2 mol/L HCl處理、4 mg/L蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37預雜交1

14、2 h，以2 mg/L的探針濃度配成雜交液，在42恒溫水浴中雜交36 h，其后分別經(jīng)梯度遞減的系列標準檸檬酸鹽溶液漂洗，再置入地高辛抗體工作液（11 000）中，37下1 h，分別依次用PBS、緩沖液和緩沖液漂洗，加入新鮮配制的顯色液，室溫避光顯色12 h，用緩沖液終止反應，最后用酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。1原位雜交陰性對照：在雜交前需用RNA酶（105 U/L）于37下預處理細胞標本30 min，雜交液中不加標記探針。2原位雜交陽性對照：雜交前不用RNA酶處理標本，雜交探針用-actin。五、還原型輔酶硫辛酰胺脫氫酶（nicotinamide-adenine dinucleot

15、ide phosphate，NADPH）組織化學染色方法：將新鮮牛眼小梁細胞標本用4多聚甲醛固定，以0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共2次；在下列配置的新鮮工作液中反應1 h：1.5 mg NADPH（上海生物制品研究所產(chǎn)品），0.375 mg四硝基唑藍（nitroblue tetrazolium, NBT，美國Sigma公司產(chǎn)品），1.5 Tris-HCl緩沖液（含0.25% Triton X-100）；雙蒸餾水終止反應；明膠玻片貼片，晾干；常規(guī)脫水、透明、封片。六、像分析及統(tǒng)計學方法將各組原位雜交和免疫組化染色標本置顯微鏡下取20個細胞，用TJTY-300型全自動醫(yī)學像分析系統(tǒng)

16、測吸光度A值，以SAS軟件分別對測得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。結果一、小梁細胞形態(tài)特點小梁組織塊接種57 d后，小梁細胞開始從組織塊周圍長出，貼壁并向遠處移行。原代細胞形態(tài)大小不一，傳代后細胞形態(tài)逐漸趨于一致。小梁細胞核仁明顯，細胞表面有長短不一的突起，有絨毛狀皺褶，有些細胞呈扇形散開（1）。隨著細胞傳代次數(shù)增多，小梁細胞形態(tài)逐漸紊亂，甚至重疊生長。1相差顯微鏡下活的小梁細胞×200二、波形蛋白免疫組化染色結果小梁細胞波形蛋白染色為陽性，胞漿呈棕黃色（3）。2小梁細胞波形蛋白免疫組化染色陽性×100三、原位雜交檢測iNOS mRNA的表達iNOS mRNA的表達呈藍色顆粒，主要

17、分布于胞漿及核仁。對照組小梁細胞有較弱的雜交信號（3）；加壓組iNOS mRNA表達呈隨壓力增高而逐漸增高的趨勢（4，5）。全自動像分析結果（以吸光度A值表示）：對照組為0.110 8±0.010 9,加壓20 mm Hg組為0.111 0±0.005 7,加壓40 mm Hg組為0.157 0±0.007 2,加壓60 mm Hg組為0.162 5±0.007 6,加壓80 mm Hg組為0.189 4±0.010 8。對照組與加壓20 mm Hg組相比，吸光度A值差異無顯著性（t=0.095 1,P>0.05）；與加壓40、60 mm

18、 Hg組相比，A值差異均有顯著性（t值分別為0.038 1和0.032 4,P<0.05）；與80 mm Hg組相比，A值差異有非常顯著性（t=0.000 16,P<0.01）；40 mm Hg組與60 mm Hg組相比，A值差異無顯著性（t=0.112 3,P>0.05）；而60 mm Hg組與80 mm Hg組相比，A值差異有非常顯著性（t=0.004 5,P<0.01）。3不加壓組，小梁細胞iNOS mRNA原位雜交，呈弱陽性×2004壓力為60 mm Hg組，小梁細胞iNOS mRNA原位雜交×2005壓力為80 mm Hg組，小梁細胞iNO

19、S mRNA原位雜交×200四、NOS蛋白質(zhì)NADPH染色NOS蛋白質(zhì)NADPH染色陽性顆粒呈藍色，僅分布于胞漿中（6）。對照組亦有一定量的表達，加壓組的蛋白質(zhì)含量隨著壓力的增高而增高。像分析結果（以吸光度A值表示）基本與mRNA表達相同：對照組為0.141 2±0.001 3,加壓20 mm Hg組為0.147 9±0.005 5,加壓40 mm Hg組為0.171 0±0.006 2,加壓60 mm Hg組為0.182 4±0.007 0,加壓80 mm Hg組為0.200 6±0.008 9。僅加壓40 mm Hg組與60 mm

20、 Hg組吸光度A值差異有顯著性（t=0.042 0,P<0.05）。結果提示壓力可刺激小梁細胞合成NOS，并在壓力逐漸增高時表達增強。6壓力為40 mm Hg組，小梁細胞NADPH組織化學染色×200討論一、采用體外培養(yǎng)的小梁細胞模型進行青光眼研究的意義以體外培養(yǎng)的小梁細胞為模型，進行病理、生理及藥理學等方面的研究是目前國內(nèi)外青光眼實驗性研究的重要手段之一。我們參照王林等1及Hernandez等2的組織塊培養(yǎng)方法進行牛眼小梁細胞培養(yǎng)，其細胞的生長周期、形態(tài)學特點及波形蛋白免疫組織化學陽性染色的表達特點均與其他作者報道的相似1，3。因此，我們采用此細胞系為模型，研究壓力對iNOS

21、 mRNA的表達及其對蛋白質(zhì)合成的影響。二、NO的生化代謝特點及其生物學效應NO是近十余年來新發(fā)現(xiàn)的小分子活性物質(zhì)，其在循環(huán)、呼吸、消化、內(nèi)分泌、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)中的生理、生化、病理及藥理學意義已成為近幾年研究的熱點之一。內(nèi)源性NO的半衰期很短（約1020 s），其代謝途徑主要是：L-精氨酸、分子氧、NADPH和ATP在NOS催化下，轉(zhuǎn)化為L-胍氨酸，然后進一步氧化生成穩(wěn)定的NO和代謝終產(chǎn)物而失去活性。已知NO通過興奮鳥苷酸環(huán)化酶使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）增加，通過依賴cGMP的蛋白激酶調(diào)節(jié)磷酸二酯酶和離子通道，以產(chǎn)生多種生物學效應4。三、NOS的分型及其病理、生理作用一般將NOS分為結構型酶（c

22、onstitutive nitric oxide sythase , cNOS）和iNOS。cNOS本身以無活性形式存在于細胞內(nèi)，依賴Ca2+激活后，僅產(chǎn)生少量的NO（10-12 mol/L）以維持正常的生理功能5；而iNOS在正常的生理情況下并不存在，在細胞因子等刺激因素作用下，可誘導iNOS mRNA的表達，并合成iNOS。我們采用的加壓方法也可達到同樣目的。iNOS的特點是不需Ca2+和鈣調(diào)節(jié)蛋白的參與，即可產(chǎn)生大量的NO（10-9 mol/L）5。在眼內(nèi)NO具有極為復雜的雙重性：（1）cNOS催化的NO主要參與維持眼的正常生理功能，如調(diào)節(jié)血管的張力，增加血液供應；擴張小梁網(wǎng)，影響房水動

23、力學，增加房水流暢系數(shù)和降低眼內(nèi)壓；作為神經(jīng)遞質(zhì)參與光的傳導等6，7。（2）iNOS催化產(chǎn)生的NO遠遠高于生理含量，通過增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，作為強自由基破壞細胞的呼吸鏈，耗竭細胞的ATP，挫傷DNA，產(chǎn)生細胞毒性作用，最終導致細胞凋亡8。本實驗中發(fā)現(xiàn)小梁細胞中的iNOS mRNA表達量及蛋白質(zhì)合成量均隨壓力的逐漸增高而增大，且iNOS mRNA的含量與蛋白質(zhì)合成量NO的產(chǎn)生變化基本平行。實驗結果提示眼壓因素在青光眼的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可單獨成為激活iNOS的刺激因素。對照組和壓力為20 mm Hg組小梁細胞的iNOS mRNA呈弱表達，同時免疫組化染色也呈弱陽性，這可能與iNOS和

24、cNOS的基因序列有一定的同源性有關。已有研究表明生理狀態(tài)下小梁網(wǎng)上含有cNOS9。四、iNOS與青光眼的關系高眼壓激活iNOS，可能與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維的損傷有關。NO為嗜脂性物質(zhì)，易于穿透細胞膜直接擴散或進入靶細胞10，高眼壓激活并產(chǎn)生過量的NO,不僅以其較強的細胞毒性作用損傷小梁細胞，引起小梁網(wǎng)功能缺失，房水流出阻力增加，而且將損傷小梁網(wǎng)周圍的組織，如葡萄膜和視網(wǎng)膜。已有研究表明，NO在擴張血管的同時增加了血管的通透性，使細胞及蛋白質(zhì)滲出增加。由此推測虹膜睫狀體的血管擴張導致了房水的分泌量增大，繼而房水中的細胞及蛋白質(zhì)增多，又加大了房水流出的阻力。Neufeld等11用NOS多克隆抗體檢測開

25、角型青光眼患者視乳頭的NOS含量時發(fā)現(xiàn)，青光眼患者的各型NOS含量明顯高于正常人，并認為iNOS加速了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的退行性變，而cNOS則有擴張血管、增加組織血液供應和保護視神經(jīng)的積極作用。綜上所述，壓力可以單獨激活小梁細胞iNOS mRNA的表達，增加細胞內(nèi)iNOS含量，由此產(chǎn)生超生理作用的NO可能成為損傷小梁細胞、導致或加重青光眼的因素之一。因此，研究NO在青光眼發(fā)病機制中的作用，旨在從新的角度防治青光眼。作者單位：薛蔚(430030 武漢，同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院眼科)杜蜀華(430030 武漢，同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院眼科)李勇(同濟醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院普外科)黃愷(同濟醫(yī)科大學附

26、屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科)參考文獻1.王林，魏厚仁，曾水清，等. 人眼小梁細胞組織培養(yǎng)及超微結構觀察. 中華眼科雜志, 1989,25: 97-99.2.Hernandez MR, Weinstein BI, Schwartz J. et al. Human trabecular meshwork cells in culture: morphology and extracellular matrix components. Invest Ophthalmol Vis Sci,1987, 28: 1655-1660.3.賀翔鴿，李美玉.人眼小梁細胞培養(yǎng)及免疫組化特性研究.中華眼科雜志，1998,

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