基于聚酰亞胺基底的細(xì)胞電融合芯片的研制

1、基于聚酰亞胺基底的細(xì)胞電融合芯片的研制         11-04-23 14:52:00     編輯：studa20                 作者：胡寧楊軍鄭小林 陰正勤 徐海偉           

2、0;      張興國曹毅 楊靜 夏斌 許蓉 鄢佳文 蔣鳳【摘要】  基于柔性印刷電路板(flexible printed circuits board, FPCB)技術(shù)，通過在聚酰亞胺基底薄膜表面層壓的銅箔上刻蝕微電極陣列結(jié)構(gòu)制備了一種細(xì)胞電融合芯片。在低電壓(40 V)條件下實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞電融合，融合效率達(dá)37%，遠(yuǎn)高于聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)法及傳統(tǒng)細(xì)胞電融合方法。與傳統(tǒng)細(xì)胞電融合系統(tǒng)相比，此芯片可在低電壓條件下工作，具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉、實(shí)驗(yàn)過程可觀察、融合通量高等優(yōu)點(diǎn)。另外，聚酰亞胺薄膜基底良好的柔軟

3、度可保證此芯片與其它分析模塊(如細(xì)胞篩選分離模塊)的有效集成，具備構(gòu)造微全分析系統(tǒng)(micro total analytical system, TAS)的巨大潛力。 【關(guān)鍵詞】  聚酰亞胺薄膜，電融合，芯片，微電極，柔性印刷電路板1 引 言隨著微機(jī)電系統(tǒng)(micro electromechanical system，MEMS)技術(shù)的快速發(fā)展和生命科學(xué)研究的現(xiàn)實(shí)要求，細(xì)胞電融合與生物芯片技術(shù)的結(jié)合逐漸深入，關(guān)于細(xì)胞電融合芯片的研究也越來越多15。目前，細(xì)胞電融合芯片融合通量普遍較低6，難以滿足高效融合的要求。此外，細(xì)胞電融合微全分析系統(tǒng)(micro total analytical

4、system, TAS)的概念也對芯片的集成和整體封裝提出了更高要求7?，F(xiàn)有融合芯片主要用硅材料加工，但是由于硅片面積、工藝及成本的限制，不利于加工大規(guī)模的微電極陣列，從而限制了硅芯片技術(shù)的融合通量。此外，硅芯片的高硬度和不透明性也為芯片封裝及實(shí)驗(yàn)觀察帶來了不利影響。本研究結(jié)合柔性印刷電路板(flexible printed circuits board, FPCB)技術(shù)，在面積較大的聚酰亞胺基底上加工了大量微電極組成的電極陣列，從而實(shí)現(xiàn)了一種柔性細(xì)胞電融合芯片，具備高通量融合的巨大潛力。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 材料PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);胰酶，DMEM高糖(?？寺∩?/p>

5、化學(xué)制品有限公司);標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?;1.0%纖維素酶R10酶溶液、0.5%離析酶R10(日本Yakult公司);10%甘露醇(北京鼎國生物技術(shù)公司)。CPW鹽溶液： 27.2 mg KH2PO4, 101.0 mg KNO3, 1480.0 mg CaCl2·2H2O, 246.0 mg MgSO4·7H2O, 0.16 mg KI, 0.025 mg CuSO4·5H2O溶于1 L 三次蒸餾水中，調(diào)pH值至5.8;PM緩沖液：0.3 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L CaCl2, 1.2 mol/L山梨醇。其它試劑均為

6、為分析純。HEK293細(xì)胞的制備：取生長良好的HEK293細(xì)胞，棄上清液。以3 mL PBS沖洗，棄上清液，反復(fù)進(jìn)行3次。加入PBS和胰酶各23滴，消化1 min。加入35 mL培養(yǎng)液，其中V(DMEM高糖)V(標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清)=101，將貼壁細(xì)胞洗落、吹散，移至10 mL離心管中，離心(2000 r/min， 5 min)，棄上清液。加3 mL培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散，分裝。煙草葉肉原生質(zhì)體的制備：將煙草K326無菌苗幼嫩葉片切成細(xì)絲，取1.0 g置于13%甘露醇液體中，質(zhì)壁分離(約3 h)后置于10 mL酶液中進(jìn)行酶解。酶解過程在26.5 黑暗條件下恒溫振蕩(50 r/min)1216 h。酶解結(jié)束

7、后，經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)500 r/min離心7 min。去除上清液，向所得沉淀中緩慢加入6 mL CPW21溶液(CPW鹽溶入21%蔗糖)，A. 芯片縱向結(jié)構(gòu)(section structure of chip); B. 芯片水平結(jié)構(gòu)(plane structure of chip).并使沉淀懸浮，以400 r/min離心6 min，用巴斯德吸管小心地將處于離心管上部的原生質(zhì)體帶吸出，并以CPW10溶液(CPW鹽溶入10%甘露醇)洗滌3次。2.2 芯片制作2.2.1 芯片加工 芯片加工過程：清洗聚酰亞胺薄膜，鉆孔，沉積銅箔，層壓，曝光，顯影，蝕刻形成微電極陣列結(jié)構(gòu)。鍍金，在焊盤位置噴錫，

8、外圍裁減，等離子清洗，防氧化處理(芯片縱向結(jié)構(gòu)見圖1)。通過上述處理，獲得了基于聚酰亞胺基底的細(xì)胞電融合芯片，面積為6 cm×5 cm，微電極陣列區(qū)面積為4 cm×3 cm，共有2.2×104個(gè)微電極。2.2.2 芯片封裝 制作一個(gè)不銹鋼模具，超聲清洗，烘干后用等離子清洗，隨即放入培養(yǎng)皿中，倒入混合好的V(PDMS單體)V(固化劑)=101混合物，真空去除氣泡，70 恒溫90 min，隨后沿模具邊緣切割將固化的PDMS揭下， 圖2 聚酰亞胺細(xì)胞電融合芯片F(xiàn)ig.2 Cellelectrofusion chip based on polyimide membrane

9、得到所需的PDMS蓋片。在蓋片上開出直徑2 mm的孔，置入柔性導(dǎo)管，用粘合劑固定。最后，在芯片上焊接導(dǎo)線，然后固定于培養(yǎng)皿上。將PDMS蓋片等離子清洗510 min后蓋于柔性微電極陣列芯片上，得到封閉的細(xì)胞電融合芯片(圖2)。 2.3 實(shí)驗(yàn)過程細(xì)胞以PM緩沖液調(diào)節(jié)至1 × 105個(gè)/mL，形成細(xì)胞懸浮液。向芯片中加入1.5 mL細(xì)胞懸浮液，待其充滿芯片后施加正弦排隊(duì)信號(峰值電壓Epp=6 V，頻率f=1 MHz)，完成細(xì)胞排隊(duì);隨后施加電脈沖穿孔信號(脈寬=50 s，脈沖間隙=900 ms，Epp=35 V，脈沖個(gè)數(shù)35個(gè))，最后，施加正弦促融信號(電壓峰峰值Epp=6 V，頻率f

10、=1 MHz，衰減率為-50%/min)，完成融合。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合過程由圖像采集系統(tǒng)記錄。 圖3 細(xì)胞在芯片內(nèi)部排隊(duì)效果3 結(jié)果和討論在正弦交流信號產(chǎn)生的介電電泳力作用下，細(xì)胞會(huì)按電場梯度方向排隊(duì)(圖3)。實(shí)驗(yàn)中，210 V的正弦交流電信號可使細(xì)胞間相互緊密排列形成串珠。串珠中細(xì)胞的數(shù)目與電信號大小成正比。通過調(diào)節(jié)信號的大小，可使絕大部分細(xì)胞呈兩兩排隊(duì)，如煙草原生質(zhì)體超過70%(圖3A)，HEK293細(xì)胞(轉(zhuǎn)染腺病毒后發(fā)綠色熒光)超過60%(圖3B)。細(xì)胞在20100 V的電脈沖信號作用下發(fā)生電穿孔，并在衰減的正弦促融信號作用下完成電融合(圖4)。芯片實(shí)驗(yàn)所用電信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)電融合裝置。計(jì)數(shù)分析表明，HEK293細(xì)胞的融合率達(dá)到37%，遠(yuǎn)高于PEG方法(1)和普通電融合方法(5%)。傳統(tǒng)細(xì)胞電融合系統(tǒng)多采用大型融合槽，可一次操作超過1 mL的細(xì)胞懸浮液。但它難以控制細(xì)胞的排隊(duì)過程，多細(xì)胞排隊(duì)和融合比例很高，使融合細(xì)胞失去分化能力，降