雷帕霉素聯(lián)合未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠皮膚移植免疫耐受

1、收稿日期 :2007-11-07基金項(xiàng)目 :廣東省自然科學(xué)基金 (06104600作者簡(jiǎn)介 :余 思 (1976- , 男 , 博士研究生 , 電話 訊作者 :何曉順 (1964- , 教授 , 主任醫(yī)師 , 博士生導(dǎo)師 , 電話 :02087306082, E-mail:gdtrc雷帕霉素聯(lián)合未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠皮膚移植免疫耐受余 思 , 何曉順 , 胡安斌 , 付必莽 , 馬毅 (中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植科 , 廣東 廣州 510080摘要 :目的 研究雷帕霉素聯(lián)合供者骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)小鼠同種異基因皮膚移植免疫耐受中的協(xié)同 作用 。 方法

2、健康雄性 C57BL/6小鼠和 BALB/C 小鼠分別為供者 、 受者 , 建立同種異基因皮膚移植模型 。 對(duì)照組術(shù)前術(shù)后 未給予任何免疫干預(yù)措施 ; 雷帕霉素組術(shù)后第 0天至第 6天給予雷帕霉素灌胃 ; 未成熟樹突狀細(xì)胞組將供者骨髓來源 的未成熟樹突狀細(xì)胞于術(shù)前第 7天經(jīng)尾靜脈輸注給受者 ; 聯(lián)合組將供者骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞于術(shù)前第 7d 經(jīng) 尾靜脈輸注給受者 , 并在術(shù)后第 0天至第 6天給予雷帕霉素灌胃 。 結(jié)果 對(duì)照組 、雷帕霉素組 、 未成熟樹突狀細(xì)胞組 、 聯(lián) 合組的皮膚移植物存活時(shí)間分別為 (6.9±1.9 、 (12.3±3.0 、 (17.0

3、7;3.4 、 (20.8±3.6 d 。 方差分析提示組間差異有顯著性意義 (P<0.05 ; SNK 檢驗(yàn)提示各組之間的差異均有顯著意義 。 結(jié)論 雷帕霉素能延長小鼠皮膚移植物的存活時(shí)間 ; 聯(lián)合供者 骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞可延長免疫耐受的持續(xù)時(shí)間 。 關(guān)鍵詞 :雷帕霉素 ; 未成熟樹突狀細(xì)胞 ; 免疫耐受 ; 小鼠 , 皮膚移植 中圖分類號(hào) :R658文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A文章編號(hào) :1673-4254(200803-0399-04Rapamycin combined with donor bone marrow -derived immature dendritic ce

4、lls induces mouse skin allograft toleranceYU Si, HE Xiaoshun, HU Anbin, FU Bi-mang, MA YiDepartment of Organ Transplantation, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, ChinaAbstract:Objective To investigate the synergic effects of rapamycin and donor bone marrow-derived im

5、mature dendritic cells (DCs in inducing skin allograft tolerance in mice. Methods The recipient BALB/c mice receiving transplantation of skin allograft from C57BL/6mice were divided into control group (without perioperative treatments, rapamycin group (receiving rapamycin at 1mg kg -1d -1by gavage f

6、or 7consecutive 7days after skin transplantation, immature DC group (receiving an injection of donor bone marrow-derived immature DCs of 2×106via tail vein before skin transplantation, combined group (receiving an injection of the DCs of 2×106before transplantation and rapamycin at 1mg kg

7、-1d -1for 7consecutive days after transplantation. The survival time of the skin allograft was observed in each group. Results The survival time of the skin allograft in the control, rapamycin, immature DC and immature DC +rapamycin groups were 6.9±1.9, 12.3±3.0, 17.0±3.4and 20.8±

8、;3.6days, respectively, showing significant differences among the groups (P <0.05, and SNK test also indicated significant differences between every two groups. Conclusions Rapamycin and donor bone marrow-derived immature DCs have synergic effects in inducing skin allograft tolerance in mice.Key

9、words:rapamycin; immature dendritic cells; immune tolerance; mouse; skin transplantation尋求有效的免疫耐受誘導(dǎo)方案一直是移植學(xué)家 追求的目標(biāo) 。 最近幾年 , 免疫抑制劑誘導(dǎo)免疫耐受的 作用逐漸受到重視 , 尤以雷帕霉素被研究得最深入 , 最有應(yīng)用前景 1,2。 但免疫抑制劑誘導(dǎo)免疫耐受的效 果尚不確切 , 多與其它方案聯(lián)合使用 。 未成熟 DC 一 直是移植免疫耐受的研究熱點(diǎn) 。 但未成熟 DC 在受者 體內(nèi)發(fā)育為成熟 DC 后 , 免疫耐受狀態(tài)也隨之消失 , 因而需要研究更持久的誘導(dǎo)免疫耐受的方案 。

10、本實(shí)驗(yàn) 聯(lián)合使用雷帕霉素和供者骨髓來源的未成熟 DC 對(duì) 皮膚移植受者進(jìn)行處理 , 結(jié)合皮膚移植物存活情況 , 探討誘導(dǎo)小鼠同種異基因皮膚移植免疫耐受的效果 。1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 C57BL/6小鼠和 BALB/C 小 鼠 分 別 為 供 、 受 者 , 68周 齡 , 質(zhì) 量 (20±2 g , SPF級(jí) , 由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 。1.1.2試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基 (Hyclone , 小鼠粒 -巨 嗜細(xì)胞集落刺激因子 rmGM-CSF 和白介素 4rmIL-4(Peprotech , 脂多糖 LPS (Sigma ; FITC 標(biāo)記

11、的大鼠抗 小鼠 CD86、 MHC-II(Ebioscience , PE 標(biāo)記的大鼠抗小 鼠 CD40、 CD80(Ebioscience , PE-CY5標(biāo) 記 的 大 鼠 抗 小 鼠 CD11c (Caltag laboratories ; 流 式 細(xì) 胞 儀(FACSCalibur , BD 。 雷帕霉素片劑由 Wyeth 提供 。2方法2.1未成熟 DC 的制備將 C57BL/6小鼠頸椎脫位處死 , 參照文獻(xiàn) 3的2008;28(3 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) (J South Med Univ399 圖 2未成熟與成 熟 DC 的表型mature DCImmature DC圖 1培養(yǎng)第 5天

12、的未成熟 DC步驟 , 收集骨髓單核細(xì)胞 , 加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基 , 添加細(xì)胞因子 rmGM-CSF (20ng/ml 及 rmIL-4(20ng/ml , 用 25ml 培養(yǎng)瓶于 37.0 、 5%CO 2孵箱中孵育 , 在第 3、第 5天半量換液 , 第 7天收集懸 浮的和半貼壁細(xì)胞即為未成熟 DC 。 同時(shí)設(shè)一組對(duì)照 , 在培養(yǎng)的第 6天加入 LPS (1g/ml , 第 7天收集細(xì)胞作為成熟 DC 組 。2.2未成熟 DC 的檢測(cè)2.2.1形態(tài)學(xué)檢測(cè) 在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長情況 。2.2.2細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集未成熟 DC 及

13、作為對(duì)照的成熟 DC , 分別與大鼠抗 小 鼠CD11c 、 MHC-II 、 CD40、 CD80、 CD86以 105個(gè) /g 的比例反應(yīng) , 用流式細(xì)胞儀檢測(cè) ;2.2.3同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 取培養(yǎng)的未成熟 DC或成熟 DC 作為刺激細(xì)胞 , 來自受者脾臟的同種異體T 細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞 。 刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞均以 1 1的比例混合 , 另外設(shè)一組單純 T 細(xì)胞對(duì)照 。 每組 4個(gè) 復(fù)孔 , 200l/孔 , 細(xì)胞濃度 1×106/ml , 于 96孔板中共 培 養(yǎng) 96h , 培 養(yǎng) 結(jié) 束 前 16h , 在 各 孔 中 加 入 3.7×104Bq 3H-TdR

14、。收集細(xì)胞 , 用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)每分鐘放 射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值 , 結(jié)果以 4孔均值表示 。 2.3小鼠同種異基因皮膚移植術(shù)供鼠 、 受鼠均腹腔內(nèi)注射 10%水合氯醛 0.3ml/100g 麻醉 , 剃凈背部毛發(fā) , 消毒 , 于供鼠背部切取 1cm 2的圓形皮瓣 , 剃凈皮下脂肪 , 置于生理鹽水中 ; 于受鼠 背部剪去全層皮膚一塊 , 形成 1cm 2的圓形創(chuàng)面 。 將 供者皮瓣貼于創(chuàng)面 , 邊緣縫 46針 , 術(shù)區(qū)以無菌敷料 包扎 。 5d 后拆包觀察皮片存活情況 。 若移植皮變硬 、 融化脫落視為排斥 。 若皮片柔軟 、 毛發(fā)生長 、 邊緣融合 則視為生長良好 。2.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為

15、4組 :對(duì)照組術(shù)前術(shù)后未給予任何免疫 干預(yù)措施 ; 雷帕霉素組術(shù)后第 0天至第 6天給予雷帕 霉素 (1mg kg -1 d -1 灌胃 ; 未成熟樹突狀細(xì)胞組將供 者骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞于術(shù)前第 7天經(jīng)尾靜脈輸注給受者 ; 聯(lián)合組將供者骨髓來源的未成熟樹 突狀細(xì)胞于術(shù)前第 7天經(jīng)尾靜脈輸注給受者 , 并在術(shù) 后第 0天至第 6天給予雷帕霉素 (1mg kg -1 d -1 灌 胃 。 為保證實(shí)驗(yàn)技術(shù)的可靠性 , 設(shè)一同品系皮膚移植 組 , 即 BALB/C BALB/C 。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù) 據(jù) 采 用 均 數(shù) ±標(biāo) 準(zhǔn) 差 表 示 , 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 軟 件 為SPSS13.0

16、, 方差分析檢驗(yàn)各組均數(shù)間的差異 , 如果差異有顯著意義 , SNK 檢驗(yàn)進(jìn)一步行多重比較 。 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。3結(jié)果3.1未成熟 DC 的檢測(cè)3.1.1形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng) 24h 后 , 可見貼壁的單核細(xì)胞均勻分布 。 3d 后大量的細(xì)胞疏松的貼附于板壁上 呈簇狀生長 , 呈葡萄串 。 5d 后細(xì)胞集落增多 , 呈懸浮 生長 , 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則 , 表面有大量星狀毛刺 (圖 1 。3.1.2細(xì) 胞 表 面 標(biāo) 志 物 的 流 式 細(xì) 胞 儀 檢 測(cè) 未 成 熟DC 細(xì)胞表面 CD11c 、 MHC-II 、 CD40、 CD80、 CD86的 表 達(dá) 率 分 別 為 66.

17、87%、 14.78%、 22.11%、 2.32%、 26.48%, 與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的未成熟 DC 表型一致 4; 而對(duì) 照 組 的 成 熟 DC 分 別 為 67.47%、 76.22%、 48.82%、 80.82%、 47.93%(圖 2 。3.1.3同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 與對(duì)照組相比 , 未成 熟 DC 組的每分鐘放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)均值輕微升南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) (J South Med Univ 第 28卷400 注 :刺激指數(shù) =試驗(yàn)組每分鐘放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值 /對(duì)照組每分鐘放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值 ;未成熟 DC 組與成熟 DC 組的每分鐘放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值存在顯著差異 (P<0

18、.05表 1各實(shí)驗(yàn)組 DC 激發(fā)未致敏 T 細(xì)胞增殖能力比較 (±s 實(shí)驗(yàn)分組 孔數(shù) 放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值 (min -1刺激指數(shù) (SI 對(duì)照組 4421.12±122.72-未成熟 DC 組 4494.06±83.721.17成熟 DC 組 41378.44±477.323.27高 , 刺激指數(shù) (SI 為 1.17; 成熟 DC 組的每分鐘放射 性熒光閃爍計(jì)數(shù)均值明顯升高 , SI 為 3.39(表 1 。3.2皮膚移植物的肉眼及組織病理學(xué)檢查對(duì)照組在第 7天左右移植皮片融化脫落 , 雷帕霉 素組在第 12天左右移植皮片融化脫落 , 而未成熟 DC

19、組和聯(lián)合組分別在第 17天和第 20天左右移植皮片才 出現(xiàn)壞死脫落 。 各組取第 7天的皮片送病理檢查 , 光 鏡下 , 對(duì)照組的移植皮片表皮層斷裂 , 腺體結(jié)構(gòu)消失 , 大量炎癥細(xì)胞浸潤 (圖 3 。 雷帕霉素組移植皮片皮下 組織有出血 , 腺體結(jié)構(gòu)不完整 , 但炎癥細(xì)胞浸潤較對(duì) 照組明顯減輕 (圖 4 。 未成熟 DC 組和聯(lián)合組的移植 皮片各層結(jié)構(gòu)及皮膚附屬器形態(tài)完整 , 有相對(duì)少的炎 癥細(xì)胞浸潤 (圖 5、 6 。 同品系移植組的皮膚移植物存 活率 >90%, 且存活時(shí)間 >100d , 說明實(shí)驗(yàn)技術(shù)可靠 。3.3各組皮膚移植物的存活時(shí)間對(duì)照組 、 雷帕霉素組 、 未成熟

20、DC 組 、 聯(lián)合組的皮 膚 移 植 物 存 活 時(shí) 間 分 別 為 (6.9±1.9 、 (12.3±3.0 、(17.0±3.4 、 (20.8±3.6d 。 各組之間的差異有顯著意義(P<0.05 。 說明雷帕霉素可延長移植皮片的存活時(shí)間 ; 而且 , 聯(lián)用供者來源的未成熟 DC , 可使移植皮片 的存活時(shí)間進(jìn)一步延長 。4討論新型免疫抑制劑雷帕霉素于 1999年被 FDA 批 準(zhǔn)用于臨床腎移植 , 其發(fā)揮免疫抑制作用時(shí) , 與細(xì)胞 漿中的 immunophilin 結(jié)合蛋白相結(jié)合 , 結(jié)合部分與FK506相 同 , 即 FKBP12。 所

21、形 成 的 雷 帕 霉 素 -FKBP12復(fù)合物能夠特異性的干擾鈣離子依賴性通道 , 阻止由 IL-2、 IL-6調(diào) 節(jié) 的 信 息 傳 遞 過 程 , 抑 制 P70S6蛋白激酶的磷酸化及其活性 。雷帕霉素誘導(dǎo)免 疫耐受的作用是通過影響樹突狀細(xì)胞和 T 細(xì)胞的功 能來實(shí)現(xiàn)的 。 體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證實(shí) , 雷帕霉素不僅 明顯抑制 DC 共刺激分子 CD86的表達(dá)從而影響樹 突 狀 細(xì) 胞 的 成 熟 過 程 以 及 向 T 細(xì) 胞 呈 遞 抗 原 的 能 力 , 而且也抑制 DC 在體內(nèi)的遷移能力 5, 6。 雷帕霉素 抑制 DC 表面 IL-18R 和 的表達(dá) , 從而減少 IL-12的自分

22、泌 ; 同時(shí)通過阻斷 Jak2/Stat4信號(hào)途徑阻止IL-12對(duì)自身 IL-12R 的激活過程 , 明顯抑制 DC 的功能 7。 雷帕霉素對(duì)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞也有影響 。 有實(shí)驗(yàn)證 實(shí) , 雷帕霉素在體外可以擴(kuò)增采自健康人群及 1型糖尿 病 人 的 CD4+CD25+FOXP3+Tr , 同 時(shí)誘導(dǎo) CD4+CD25-T 效應(yīng)細(xì)胞的消亡 8。 雷帕霉素還可以增加反應(yīng)性 T 細(xì) 胞對(duì) CD8+否決細(xì)胞的易感性 , 促進(jìn) 后者引發(fā)的 T 細(xì)胞調(diào)亡 9。本實(shí)驗(yàn)中 , 雷帕霉素組的移植皮 片在術(shù)后 7d 時(shí)已經(jīng)觀察到明顯的炎癥細(xì)胞浸潤 , 但皮片仍存活至 12d 左 右 , 提示雖有免疫抑制存在 ,

23、但雷帕 霉素的誘導(dǎo)免疫耐受作用 可 能 也 發(fā) 揮了作用 。未 成 熟 DC 已 經(jīng) 被 發(fā) 現(xiàn) 具 有 誘 導(dǎo)免疫耐受的作用 。 本研究證實(shí) , 靜 脈輸注供者骨髓來源的未成熟 DC ,可使同種異基因小鼠皮膚 移 植 物 存 活時(shí)間延長 。未 成 熟 DC 誘 導(dǎo) 免 疫 耐 受 的 另 一個(gè)主要機(jī)制是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞的 產(chǎn)生 10。 調(diào)節(jié)性 T 細(xì) 胞 (Regulatory Tcells,Tr 是 Sakaguchi 等 11于 1995年首先報(bào)道 , 表型為 CD4+CD25+的一類 T 細(xì)胞亞群 。 CD4+CD25+Tr 能 夠 分 泌 IL-4、 IL-10、 TGF-, 表

24、 達(dá) IL-2R (CD25 、 細(xì) 胞 毒 性 T 淋 巴 細(xì) 胞 抗 原 4圖 3對(duì)照組的移植皮片 (術(shù)后 7d ; 黑箭頭示血管炎癥 , 白箭頭示浸潤的單核細(xì)胞 圖 4雷帕霉素組的移植皮片 (術(shù)后 7d ; 黑箭頭示毛囊炎癥 , 白箭頭示浸潤的單核細(xì)胞 圖 5未成熟 DC 組的移植皮片 (術(shù)后 7d ; 白箭頭示浸潤的單核細(xì)胞 圖 6聯(lián)合組的移植皮片 (術(shù)后 7d ; 白箭頭示浸潤的單核細(xì)胞 46余 思 , 等 . 雷帕霉素聯(lián)合未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠皮膚移植免疫耐受第 3期401 (CTLA-4 分子及轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3, 對(duì)效應(yīng)性 T 細(xì)胞 具有抑制作用 。 研究表明 , IL-1

25、0和 TGF-均能抑制 抗原特異性免疫應(yīng)答 ; IL-10還可誘導(dǎo) CD4+T 細(xì)胞處 于長期的抗原特異性無能狀態(tài) , 表現(xiàn)為抗原刺激下不 增殖和不分泌細(xì)胞因子 12, 13。 DC 的成熟或活化狀態(tài) 對(duì) CD4+CD25+Tr 的功能發(fā)揮起著重要的影響 。 外周 不成熟 DC 攝取抗原成分 , 進(jìn)入次級(jí)淋巴結(jié) , 刺激 T 細(xì)胞前體分化為 CD4+CD25+Tr ; 后者一方面抑制抗原 特異性 T 細(xì)胞增殖 , 另一方面通過分泌 IL-10、 TGF-負(fù)反饋下調(diào) DC 表面 MHC-II 和伴隨分子 , 經(jīng)細(xì)胞接 觸方式抑制 DC 的抗原呈遞功能降低 DC 的成熟狀 態(tài) , 導(dǎo)致生成更多的調(diào)

26、節(jié)性 T 細(xì)胞 14-16。供者骨髓來源的未成熟 DC 也可能參與了中樞 性免疫耐受 , 即 “ 克隆刪除 ” (clonal deletion 學(xué)說 。 未 成熟 DC 可以攜帶供者抗原進(jìn)入受者胸腺 , 參與受者T 細(xì)胞發(fā)育過程中的陰性選擇 。本實(shí)驗(yàn)中 , 未成熟 DC 組的移植皮片明顯延長 , 說明供者來源的未成熟 DC 具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫耐 受的作用 。 但是 , 輸入供者來源的未成熟 DC , 雖然延長了皮膚移植物的存活時(shí)間 , 但到了一定時(shí)間仍將發(fā) 生排斥 。 這是因?yàn)?, 隨著未成熟 DC 逐步成熟 , 其誘導(dǎo) 免疫耐受的作用將逐步減弱 。 因此 , 如何維持 DC 在 受者體內(nèi)的

27、未成熟狀態(tài) , 成為一個(gè)待解決的問題 。而且 , 未成熟 DC 在誘導(dǎo)免疫耐受的同時(shí) , 并不 能 夠 完 全 保 護(hù) 供 者 的 移 植 物 免 于 受 者 T 細(xì) 胞 的 攻 擊 。 因?yàn)槭苷唧w內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞可通過直接和間接 識(shí)別途徑向受者 T 細(xì)胞呈遞同種異型抗原 , 使受者 T 細(xì)胞活化 、 增殖 , 進(jìn)而攻擊供者移植物 。 從病理圖片也 看出 , 存活的移植皮片內(nèi)有一定數(shù)量的炎癥細(xì)胞存 在 。 但由于大量供者來源未成熟 DC 的存在 , 總體上 并未表現(xiàn)出對(duì)移植物的排斥反應(yīng) 。 如果同時(shí)給予適當(dāng) 的免疫抑制 , 將有可能延長皮膚移植物的存活時(shí)間 。有鑒于此 , 本實(shí)驗(yàn)利用雷帕霉素和

28、未成熟 DC 的 誘導(dǎo)免疫耐受的作用 , 以及雷帕霉素的免疫抑制的作 用 , 聯(lián)合使用二者對(duì)受體小鼠進(jìn)行處理 。結(jié)果證實(shí) , 口 服雷帕霉素 , 聯(lián)合輸注供者來源的未成熟 DC , 可使 小鼠皮膚移植物的存活時(shí)間進(jìn)一步延長 , 說明這兩種 方式對(duì)誘導(dǎo)免疫耐受有協(xié)同作用 。 本實(shí)驗(yàn)為研究移植 免疫耐受提供了一個(gè)新的思路 。 需要進(jìn)一步深入研究 的問題是 , 在分子水平上闡明未成熟 DC 、雷帕霉素 、 T 細(xì)胞相互作用的各個(gè)環(huán)節(jié) , 以及外在和內(nèi)在的調(diào)節(jié)機(jī)制 , 最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)持久的免疫耐受 。 參考文獻(xiàn) :1Ryu U, Rolf NB, Richard SL, et al. Inductio

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