電針對大鼠腦缺血再灌注模型P

1、電針對大鼠腦缺血再灌注模型P               作者：劉玉珍，韓景獻，蔣戈利，丁曉榮，陸明霞【關(guān)鍵詞】  針刺；,腦缺血/再灌注；,P摘要：目的探討針刺抗腦缺血再灌注炎性損傷的機理。方法采用線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血模型（MCAO），采用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定P-選擇素和E-選擇素表達的動態(tài)變化。結(jié)果在灌注3 h各實驗組P選擇素和E選擇素均開始表達，二者均于再灌注24 h均達到高峰（組內(nèi)比較P0.01），持續(xù)至再灌注48 h，針刺可顯著

2、降低P-選擇素和E-選擇素的表達（與模型組和非穴組比較，P0.01 ）。結(jié)論P選擇素和E選擇素的表達上調(diào)與再灌注后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，早期針刺治療可能通過下調(diào)腦缺血區(qū)黏附分子P選擇素和E選擇素的表達而防治腦缺血再灌注炎性損傷。關(guān)鍵詞：針刺；  腦缺血/再灌注；  P選擇素；  E選擇素Effect of Galvano-acupuncture on the Expression of P-selectin and E-selectin of Cerebral Ischenic Region in RatsAbstract：ObjectiveTo study mecha

3、nisms of early treatment of cerebral ischemia-reperfusion(I/R) by galvano-acupuncture in resisting inflammation injury in rats.MethodsCerebral I/R model was established by occlusion of the middle cerebral artery for 1h and then removal of the occlusion for 3 h ,12 h,24 h, and 48 h respectively .The

4、expression of P-selectin and Eselectin was displayed by using imunohistochemical ABC in ischemic cerebral cortex and corpus striatum in rats.ResultsThe expression of P-selectin and Eselectin was detected at capillary walls in postischemic cerbral cortex at 1 h ischemia-3 h reperfusion and peaked at

5、1h ischemia-24 h reperfusion and increased continuously during 48 h reperfusion.The expression of both Pselectin and Eselectin in ischemic cerebral cortex were downregulated considerably by galvano-acupuncture treatment (P0.01) .ConclusionThe protective effect of acupuncture on cerebral neurons unde

6、r acute infarction is possible through its downregulative action on the expression of Pselectin and Eselectin,which causes neutrophil infiltration that induced by adhesive molecules between endothelium cell  and neutrophil.Key words：Acuppuncture;  Cerebral ischemic/reperfusion ;  Psel

7、ectin;  Eselectin    近年研究表明，腦缺血及腦缺血再灌注的病理過程中，周圍血中性粒細(xì)胞向缺血區(qū)的遷移、浸潤引發(fā)炎癥反應(yīng)加重了腦損傷，P選擇素（Pselectin）和E-選擇素（Eselectin）在白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞作用的起始階段發(fā)揮重要作用。本課題擬建立大鼠局灶性腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）損傷模型，實施針刺干預(yù)，觀察針刺對腦血區(qū)P選擇素和E選擇素表達的影響，旨在證明早期針刺治療對腦缺血損傷的有效防治途徑是通過對腦缺血后炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機制實現(xiàn)的。1  材料與方法1.1  動物

8、分組健康雄性Wistar大鼠130只，體重（260±20）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。按隨機分組原則分成以下幾組：假手術(shù)組與實驗組，實驗組分為腦缺血1 h/再灌注3，12，24，48 h模型對照組（模型組）、非穴位針刺組（非穴組）和電針治療組（電針組）。每組各10只。1.2  腦缺血再灌注大鼠模型的建立及組織制備參照Longa1的改良的方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。10%水合氯醛（330 mg/kg）腹腔麻醉，消毒頸部皮膚，沿頸正中線做一長度約2 cm的切口，仔細(xì)分離暴露出右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。在右側(cè)頸總動脈接近分

9、叉處以眼科剪剪一“V”形小口，將頭端用火焰燒成光滑球面（直徑為2.52.8 mm）的4-0單股尼龍線從小口緩慢插入，經(jīng)頸總動脈分叉處進入右側(cè)頸內(nèi)動脈入顱，插線深度1.82.0 cm，栓塞右大腦中動脈。消毒并縫合切口，手術(shù)過程中大鼠肛溫維持在（37±0.5）。栓塞1 h后，緩慢撥出尼龍線進行再灌注，根據(jù)所需的再灌注時間段取腦。假手術(shù)組不插線，其他同手術(shù)組。1.3  神經(jīng)病學(xué)評分按Longa15分法進行神經(jīng)病學(xué)評分：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能伸展對側(cè)前爪；2分，行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。其中，0分及4分者被剔除。1.4 

10、; 電針治療方法根據(jù)華興邦等2研制的“大鼠穴位圖譜”，選取水溝、內(nèi)關(guān)、三陰交穴。1.4.1  操作方法取人中，向鼻中隔方向斜刺，將針體旋轉(zhuǎn)360°行雀啄手法，直刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)、三陰交，行提插捻轉(zhuǎn)瀉法1 min。非穴位針刺組：選取雙側(cè)脅下2個固定非穴點，用平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法1 min。通以G6805型電針治療儀，頻率為416 Hz，波形為斷續(xù)疏密波，刺激強度為2V。持續(xù)時間為10 min。1.4.2  治療時機I/R后3 h，12 h針刺組于腦缺血即刻、再灌注即刻相應(yīng)時間點分別進行電針治療：I/R24 h，48 h針刺組除此之外每12 h治療1次。1.5  取材

11、10%水合氯醛足量腹腔麻醉大鼠，4%多聚甲醛（4，pH 7.4）用BT100恒流泵心臟灌流固定取腦，發(fā)現(xiàn)顱底淤血者剔除。從視交叉至腦橋前緣冠狀位切取腦組織2塊，每塊厚約3 mm，置于同一固定液中4，12 h，進行OCT包埋，冰凍切片機連續(xù)切片，厚度為20 m，分別每隔6張取一張貼片，貼附于載玻片，用于免疫組化，干燥，保存于20備用。1.6  免疫組化染色（ABC法）小鼠單克隆抗Pselectin抗體（1100）、免多克隆機ESelectin抗體（1100）購自Santa Cruz公司，SP法免疫組化染色，DAB顯色。1.7  陽性評定及分析在光鏡下毛細(xì)血管著色呈棕黃色為P-

12、選擇素和E-選擇素表達陽性。在400×鏡下，每組各選取5張切片，每張切片在缺血區(qū)隨機選取5個不重疊視野，用MPIAS-1000多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)（同濟醫(yī)科大學(xué)清平影像公司研制）進行圖像分析，測量血管計數(shù)（即一個視域中陽性信號的總血管個數(shù)）、積分光度（即各個單獨探測的像素密度分布的總和，反應(yīng)陽性信號的強度），分析P選擇素和E選擇素的表達情況。結(jié)果用±s表示。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0軟件進行方差分析和t檢驗。2  結(jié)果2.1  P選擇素的表達陽性染色為棕黃色的微血管和毛細(xì)血管，小血管和大血管呈陰性反應(yīng)。假手術(shù)組P選擇素?zé)o表達。在實驗組，I/R3

13、 h 腦缺血區(qū)的陽性血管開始出現(xiàn)陽性表達，I/R24 h達到高峰，持續(xù)至I/R48 h。陽性信號顯示明顯的區(qū)域性，即缺血灶中心區(qū)及半暗帶區(qū)。電針組P選擇素表達顯著減少，與模型組和非穴組相應(yīng)時間點比較，具有極顯著性差異（P0.01）。結(jié)果見表1及圖13。 2.2  E選擇素的表達陽性染色與P選擇素表達相似，假手術(shù)組E-選擇素未見表達；在實驗組，陽性血管表達在腦的不同區(qū)域也顯示出明顯的區(qū)域特征，與上述P選擇素表達在腦的分布基本一致。I/R3 h腦缺血區(qū)的陽性血管開始陽性表達，I/R24 h達到高峰，48 h仍有陽性表達。電針組E選擇素的表達明顯減少，與模型組和非穴組相應(yīng)時間點比較，具有顯

14、著性差異（P0.01）。結(jié)果見表1及圖46。表1  再灌注后腦缺血區(qū)P選擇素和E選擇素的陽性血管數(shù)目和積分光度（略）與其他各組比較，*P0.05；與模型組比較，*P0.05；與模型組和非穴組比較，P0.05,P0.01圖1I/R24 h模型組缺血區(qū)P選擇素     表達（免疫組化DAB顯色×400） （略） 圖2I/R24h非穴組缺血區(qū)P選擇素     表達（免疫組化DAB顯色×400）（略）圖3I/R24h電針組缺血區(qū)P選擇素     的表達（

15、免疫組化DAB顯色×400）（略）  圖4I/R24h模型組缺血區(qū)E選擇素     表達（免疫組化DAB顯色×400）（略）圖5I/R24h非穴組缺血區(qū)E選擇素     表達（免疫組化DAB顯色×400）（略）圖6I/R24h電針組缺血區(qū)E選擇素     表達（免疫組化DAB顯色×400）（略）3  討論炎癥反應(yīng)在腦缺血的病理損傷過程中起重要作用。研究表明，再灌注后白細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性增加，白細(xì)胞的貼壁滾動

16、、初次黏附、緊密黏附及穿越內(nèi)細(xì)胞及基膜，12 d內(nèi)主要以多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear leukocytes,PMNs）為主3，與表達在內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子有密切關(guān)系4。P-選擇素和E-選擇素是選擇素家族的重要成員，P選擇素通常儲存于內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒（Weibel Palade小體）和靜止的血小板a顆粒和致密顆粒中，缺血早期在氧自由基、NO及細(xì)胞因子腫瘤壞死因子a(TNFa)5，白介素1 (IL1)等的誘導(dǎo)下，Weibel Palade小體和血小板a顆粒迅速與質(zhì)膜融合而使P-選擇素在內(nèi)皮細(xì)胞和血小板表面表達6。P-選擇素在細(xì)胞表面的表達是內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化的標(biāo)志，它參與介

17、導(dǎo)血小板的活化及內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附，在炎癥、血栓形成中起重要作用。E-選擇素是一種血管內(nèi)皮合成的可誘導(dǎo)性單鏈糖蛋白，主要在活化的內(nèi)皮細(xì)胞上表達，體外研究發(fā)現(xiàn)TNFa，IL1，淋巴毒素和脂多糖可誘導(dǎo)E-選擇素的表達。正常內(nèi)皮細(xì)胞無E-選擇素表達，且胞內(nèi)也無儲存，它是介質(zhì)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞起始黏附作用的重要分子。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上調(diào)的P選擇素，與活化白細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）和E選擇素，以及白細(xì)胞表面L選擇素的活化實現(xiàn)了PMNs與血管內(nèi)皮的緊密黏附，最終導(dǎo)致PMNs的移行浸潤。炎癥反應(yīng)是級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要病理環(huán)節(jié)，能導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。本病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”

18、范疇，中風(fēng)病的病機關(guān)鍵是“竅閉神匿，神不導(dǎo)氣”，人中刺之可直達腦府，激發(fā)神氣再現(xiàn)；內(nèi)關(guān)治心以調(diào)脈治血；三陰交補腎滋陰生髓。三穴共奏醒腦開竅、調(diào)神復(fù)神之功。本實驗結(jié)果證實了再灌注后血管內(nèi)皮激活，使黏附分子P選擇素和E選擇素蛋白合成增加，介導(dǎo)了再灌注后白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的接觸、黏附與游出血管，形成了白細(xì)胞浸潤為核心表現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，加重了組織水腫和繼發(fā)性損傷。早期針刺治療后P選擇素和E選擇素表達明顯下調(diào)，推測針刺治療于起始階段抑制了白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，阻斷了白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移，在炎癥細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)起到抑制作用，繼而阻斷再灌注后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮其神經(jīng)元保護作用。參考文獻：1  Zea Longa EL.Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversibe middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke,1989,20(1):84.2  華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制J.實驗動物與動物實驗，1991，（1）：1.3  Yamagami S,Tamura M,Hayshi M,et al.Differential production of MCP1 and