CTC循環(huán)腫瘤細(xì)胞

1、腫瘤循環(huán)細(xì)胞（CTC）檢測(cè).行業(yè)背景中國(guó)腫瘤發(fā)病率285.91/10萬，每年新發(fā)病例321萬，6人/分鐘確診惡性腫瘤。腫瘤13標(biāo):中晚期蛋白標(biāo)記物，PSA, CA125,CA199等。影像學(xué)檢測(cè)：CT，MRI, PET，僅檢出5mm以上腫瘤。病理診斷：穿刺樣本檢測(cè)，創(chuàng)傷性。技術(shù)瓶頸：僅能檢測(cè)中晚期腫瘤、難以早期診斷 ！液體活檢：通過檢測(cè)血液及其他體液中更加特異的腫瘤指紋來實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）：腫瘤上脫落的活細(xì)胞，可能代表了轉(zhuǎn)移的種子；循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）則是來自死細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，通常以DNA短片段的形式存在。. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞，circulating tumor ce

2、ll，CTC 1896年在患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞體積和形態(tài)相似的細(xì)胞 目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞 在腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成前即可在外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞 腫瘤循環(huán)細(xì)胞的特性腫瘤循環(huán)細(xì)胞的特性 稀有性稀有性：每ml血液約107個(gè)白細(xì)胞中僅有1個(gè)CTC 非典型形態(tài)非典型形態(tài)：比血液細(xì)胞、正常組織細(xì)胞的體積大、細(xì)胞核大，不規(guī)則，核質(zhì)比高、不容易發(fā)生形變 異質(zhì)性異質(zhì)性：細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異、攜帶不同的分子信息、轉(zhuǎn)移潛力差異 易聚集成團(tuán)易聚集成團(tuán)CTM：成瘤遷移能力是CTC的23-50倍外周血細(xì)胞的遮蔽阻礙了它們的分離與分子鑒定，因此的檢

3、測(cè)是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念與特性的概念與特性.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性CTCs可以是間質(zhì)型、上皮型、上皮間質(zhì)混合型、成團(tuán)的CTCs(CTM).CTCs檢測(cè)的臨床可行性檢測(cè)的臨床可行性.健康狀態(tài)癌前病變惡性腫瘤腫瘤轉(zhuǎn)移CTC檢測(cè)臨床意義臨床意義CTC監(jiān)測(cè)分析耐藥性檢測(cè)耐藥性檢測(cè)動(dòng)態(tài)跟蹤C(jī)TC數(shù)目，判斷是否產(chǎn)生耐藥性腫瘤復(fù)發(fā)檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)檢測(cè)CTC數(shù)目增多是腫瘤復(fù)發(fā)的前兆腫瘤新藥物的開發(fā)腫瘤新藥物的開發(fā)配合研制新的抗腫瘤藥物體外早期診斷體外早期診斷腫瘤在1mm時(shí)，血液中可檢測(cè)出CTC預(yù)后判斷預(yù)后判斷根據(jù)治療前后CTC個(gè)數(shù)判斷預(yù)后及存活時(shí)間化療藥物的療效評(píng)判化療

4、藥物的療效評(píng)判根據(jù)化療前后CTC數(shù)目變化，確定藥物是否有效. 如何檢測(cè)CTCs？由于外周血中CTC非常稀少，通常CTC檢測(cè)會(huì)首先利用細(xì)胞的物理性質(zhì)或生物特性等對(duì)CTC加以分離富集。CTCs的富集：如何獲取CTCs？ 從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞CTCs的鑒定：如何鑒定所獲細(xì)胞為CTCs？ 將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè).對(duì)于分離富集的CTC可以進(jìn)行基因型或者表型分析等以計(jì)數(shù)CTC或者鑒定其分子特性免疫表型分析： 靶細(xì)胞丟失PCR分析： 高效率，高靈敏度，特異性，操作簡(jiǎn)單。 假陽性率較高、細(xì)胞形態(tài)學(xué)被破壞、需要更嚴(yán)格的

5、標(biāo)本保存條件和實(shí)驗(yàn)條件單個(gè)CTC分子信息監(jiān)測(cè)（克服白細(xì)胞污染）循環(huán)腫瘤細(xì)胞的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析鑒定分析鑒定.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集.CTCs分離分離、分型、分析、分型、分析.原原 理理技術(shù)產(chǎn)品技術(shù)產(chǎn)品免疫捕獲法免疫捕獲法(根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物)陽性富集法陽性富集法：CellsearchTM系統(tǒng)CTC芯片（CTC-chip）MACSCell Separation陰性篩選法陰性篩選法：Easy SepCyttel過濾法過濾法(根據(jù)細(xì)胞大小)ISET膜過濾 密度梯度離心密度梯度離心（根據(jù)細(xì)胞密度）OncoQuick分離體系CTCs的檢測(cè)方法及代表技術(shù)產(chǎn)品的檢測(cè)方法及代表技術(shù)產(chǎn)品.

6、免疫捕獲法磁珠分選u 原理： 將特異性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再與靶細(xì)胞上抗抗原結(jié)合成“靶細(xì)胞抗原抗體磁珠”復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下向一定方向移動(dòng)，從而富集靶細(xì)胞.u 分選策略陽性富集：使用表面耦聯(lián)抗目的細(xì)胞抗體的磁珠，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后直接在磁場(chǎng)中被分離出來。負(fù)性篩選：通過去除無關(guān)細(xì)胞使目的細(xì)胞得以純化.陽性富集CellsearchTM系統(tǒng)CTC芯片（CTC-chip）MACSCell Separation 磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)l 原理： 采用抗EpCAM（CD326）結(jié)合免疫磁珠捕獲EpCAM陽性CTCsl 特點(diǎn)：捕獲的CTCs純度較高能夠捕獲到血液中上皮型、上皮間質(zhì)混合型的CTC

7、s無法捕獲到間質(zhì)型CTCs（EpCAM陰性）. magnet Anti-EpCAM Coated ferrofluids7.5mlAnti-CK (epithelial cells)Anti-CD45 (WBCs)DAPI (viable cells )Automated fluorescence detection systemmagnet使用抗EpCAM抗體抗體包被磁微粒，使其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，在特定磁場(chǎng)作用下達(dá)到分離CTC的目的。陽性富集陽性富集-CellsearchTMCTCWBC.CellsearchTM CTCs鑒定鑒定上皮來源的CTCs的判定：DAPI（細(xì)胞核）陽性、角蛋白CKs陽

8、性、CD45陰性.芯片的表層排布了78 000個(gè)包被抗 EpCAM抗體的微位點(diǎn)血液樣本流經(jīng)芯片時(shí)，抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合粘附在芯片上制造相對(duì)困難，成本昂貴，顯微位點(diǎn)周圍的血流通暢性限制了與抗體覆蓋位點(diǎn)接觸的CTC數(shù)量陽性富集陽性富集- CTCs-Chip. 原理原理：聯(lián)合上皮細(xì)胞標(biāo)志及腫瘤特異性標(biāo)志通過免疫磁珠分選特異性腫瘤的CTCs聯(lián)合抗MUC1和EpCAM抗體檢測(cè)乳腺癌和直腸癌通過RT-PCR擴(kuò)增腫瘤標(biāo)志物來鑒定CTCs特點(diǎn)特點(diǎn)：較單一使用EpCAM抗體更特異不適用于EpCAM和CK陰性或弱化的CTCsPCR鑒定敏感性高，但易造成假陽性陽性富集- Adna Test 檢測(cè)系統(tǒng).陰性富集 Cyt

9、tel/Cytelligen 檢測(cè)系統(tǒng) 原理原理: 利用CD45磁珠抗體吸附白細(xì)胞，在磁場(chǎng)作用 下去除白細(xì)胞，CTCs被富集沉淀 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 可檢出EpCAM、CK陰性的間質(zhì)型CTCs 樣本處理步驟多，CTCs易丟失.陰性篩選法-Cyttel步驟較多，CTCs容易丟失鑒定不穩(wěn)定 判定標(biāo)準(zhǔn)：DAPI陽性、CD45陰性，8號(hào)染色體擴(kuò)增；特異性不足.基于細(xì)胞大小過濾u 原理：根據(jù)腫瘤細(xì)胞的體積大于白細(xì)胞體積分離CTCu 代表技術(shù)：濾膜濾法分離上皮源腫瘤細(xì)胞（ISET）u 方法：將全血經(jīng)過帶小孔8m的聚碳酸酯膜的過濾，即可除去白細(xì)胞 富集得到CTCs.u 特點(diǎn)：細(xì)胞完整性好；可完全分離上皮型、間質(zhì)型

10、CTCs；可檢出循環(huán)腫瘤拴子；局限：不宜檢出細(xì)胞直徑小于8m的腫瘤如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤HepG2 cells stained with anti-KL1濾膜法濾膜法.密度梯度離心 原理： 根據(jù)腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞密度不同，通過梯度離心分離CTCs OncoQuick分離體系 方法： 密度梯度離心后，白細(xì)胞通過多孔濾膜被濾除，而CTCs被富集在介 質(zhì)層中，洗脫后得到CTCs. 特點(diǎn)：可分離CK陽性和陰性細(xì)胞 局限性：CTCs遷移可能至血漿層、紅細(xì)胞層和粒細(xì)胞層而丟失；CTCs微栓子可能沉入紅細(xì)胞層而丟失；與腫瘤細(xì)胞特性、離心時(shí)間和溫度等有關(guān)；用血量多15-30ml.流式細(xì)胞術(shù) 原理：根據(jù)白細(xì)胞表達(dá)CD45

11、抗原、CK陽性CTCs表達(dá)EpCAM，采用不同熒光素標(biāo)記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細(xì)胞術(shù)分析和分選CK陽性細(xì)胞的CTC（CD45- EpCAM+） 可在檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析 敏感性較低，需要的血液樣本量大 缺乏規(guī)范的臨床操作方法.技術(shù)技術(shù)優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì)局限性局限性陽性率陽性率樣本量樣本量CellsearchTM特異性好、重復(fù)性好、可自動(dòng)化不能分型、漏檢轉(zhuǎn)移侵襲能力較強(qiáng)的間質(zhì)型CTCs及CTM71%（MBC）47%（MCRC）78%（AIPC）7.5mLCTCs-chip(HB-chip)特異性好、靈敏度高、HB芯片可富集到CTM不能分型、漏檢轉(zhuǎn)移侵襲能力較強(qiáng)的間質(zhì)型CTCs93%(MPC )0.9-