醫(yī)學(xué)博士科研計(jì)劃書(shū)

1、,.LncRNA-ANCR 基因表達(dá)對(duì)大鼠退行性脊柱側(cè)凸影響的實(shí)驗(yàn)研究退行性脊柱側(cè)凸 (degenerative scoliosis，DS)通常指機(jī)體骨骼成熟后出現(xiàn)的脊柱腰段的側(cè)凸，冠狀面 Cobb?角大于 10 °，同時(shí)可以存在矢狀面失衡和/或脊椎的旋轉(zhuǎn)異常。隨著全球人口老齡化及老年人生活方式轉(zhuǎn)變，DS 已成為導(dǎo)致脊柱畸形、影響生活質(zhì)量的一種腰椎退行性疾病。由于DS 的具體病因還未明確解釋?zhuān)?dāng)前關(guān)于 DS 的研究絕大多數(shù)是針對(duì)治療，涉及病因?qū)W方面的基礎(chǔ)研究很少。因此，進(jìn)一步研究 DS 的病因及發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(Long non-coding RNA ，

2、LncRNA) 是長(zhǎng)度大于 200 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA 。研究表明， LncRNA 在調(diào)控表觀遺傳、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化等細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并與人類(lèi)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其中包括癌癥、退行性疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。其中， ANCR （anti-differentiation ncRNA ，抗分化 ncRNA ）為一個(gè) 855bp lncRNA ，在細(xì)胞分化期間下調(diào)。ANCR 在包含祖細(xì)胞群體中的減少，沒(méi)有任何其他刺激，導(dǎo)致快速分化基因誘導(dǎo)。本研究正是選擇LncRNA-ANCR 這一基因，旨在通過(guò)研究該基因和大鼠DS 之間作用關(guān)系，

3、為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究DS 的發(fā)病機(jī)理，希望從發(fā)病的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上預(yù)防該類(lèi)型疾病發(fā)生。參考文獻(xiàn)（ 1）Dalle-Carbonare L，Innamorati G，Valanti MT Transcription factor Runx2 and its application to bone tissue engineeringJStem Cell Rev，2012，8(3)：891897.（ 2）Liu TM ，IR EH Transcriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bone developmentJ Tissue E

4、ng Part B Rev，2013，19(3)：254263.;.,.（ 3）Lin Zhu ，Pei-Cheng Xu，Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblastdifferentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ，Biochemical and Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617.（ 4） Glass DA. Canonical Wnt signaling in differentiated

5、 osteoblasts controls osteoclast differentiationJDev Cell，2010，104(9)： 1670216707.（ 5）劉錫梅，馬越鳴，丁伯平等，大鼠兩種骨質(zhì)疏松模型的建立 J. 皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2001,20(1)：4-5.（ 6）劉曉陽(yáng)，邱貴興，翁習(xí)生等，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸中的表達(dá)研究 J.中國(guó)骨與關(guān)節(jié)外科， 2014,3（ 7） :235-240.（ 7） Daffner SD，Vaccaro AR. Adult degene rative lumbarscoliosis.Am J Orthop, 2003,3

6、2(2):77-82.（ 8） Kretz M , Webster DE , Flockhart RJ?etc, Suppression of progenitordifferentiation requires the long noncoding RNA ANCRJ, Genes Dev.2012，26 (4) ：338343.（ 9）李慧章，葉君健。骨形態(tài)發(fā)生蛋白在椎間盤(pán)退變中的研究 J. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005,39（1）： 53-55.（ 10）Cui M;Wan Y;Anderson DG. Mouse growth and differentiation factor-5

7、protein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ. Spine Journal，2008，8（ 2）:287-295.創(chuàng)新點(diǎn)：LncRNA 是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，在癌癥方面研究相對(duì)較多，本研究借此熱點(diǎn)探討LncRNA-ANCR 在大鼠 DS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。若探明 LncRNA-ANCR 和 DS 之間的作用關(guān)系，從而人為地調(diào)控LncRNA-ANCR的作用機(jī)制，從早期防治DS，為防治 DS 開(kāi)辟一個(gè)新思路。;.,.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與技術(shù)路

8、線：1重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定（ 1）根據(jù) LncRNA-ANCR 前體序列應(yīng)用 Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物。（ 2）利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增出 LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列。（ 3） LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列重組入腺病毒 miRNA 表達(dá)載體。（ 4）應(yīng)用 Lipofeetamine 2000 將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染如 293T 細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。（ 5）收集、濃縮、純化和滴定重組 LncRNA-ANCR 腺病毒。2. 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體

9、轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 的細(xì)胞學(xué)研究（ 1）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、培養(yǎng)選取 2 月齡大鼠，無(wú)菌條件下獲取自體骨髓，用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行分離、培養(yǎng)，獲得自體原代骨髓干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。應(yīng)用CD45、 CD34、CD29、 CD105 單克隆抗體， FACS（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)BMSCs 表面抗原表達(dá)。細(xì)胞分組：基因組： LncRNA-ANCR 載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs無(wú)關(guān)序列組：無(wú)關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs空載體組：空載體的BMSCs空白對(duì)照組：無(wú)特殊處理的BMSCs（ 3）檢測(cè) BMSCs 分化指標(biāo)TaqMan RT-PCR和 Western-blot 方法分

10、別檢測(cè)各組BMSCs 內(nèi) BMP7 mRNA 、Runx2 mRNA 和 GDF5 mRNA 以及相應(yīng)蛋白表達(dá)3. 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體對(duì)大鼠DS 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究;.,.（ 1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：剛斷乳的 SD 大鼠 50 只，分 5 組，每組 10 只。（ 2）實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組：無(wú)特殊處理模型組：僅雙上肢截肢空載體組：雙上肢截肢 +注射空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs無(wú)關(guān)序列組：雙上肢截肢+注射無(wú)關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs基因組：雙上肢截肢 +注射 LncRNA-ANCR 載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs（ 3）影像學(xué)觀察測(cè)量大鼠脊柱形態(tài)變化（ 4）病理學(xué)：觀察椎體和椎間盤(pán)病理變化（ 5）基因表達(dá)： TaqMan RT-PCR檢測(cè) BMP7 mRNA 、Runx2 mRNA 和 GDF5 mRNA 表達(dá)（ 6）蛋白表達(dá)： Westernblot 檢測(cè) BMP7、Runx2 和 GDF5 蛋白表達(dá)預(yù)期目標(biāo)和意義：成功構(gòu)建和鑒定重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體。將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體轉(zhuǎn)染到 BMSCs 細(xì)胞中，阻斷或顯著抑