代謝工程及其在產(chǎn)苯丙氨酸基因工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用

1、代謝工程及其在產(chǎn)苯丙氨酸基因工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用劉云徐琪壽(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所,北京100850)摘要本文對(duì)代謝工程的發(fā)展?fàn)顩r從研究方法,在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及環(huán)保中應(yīng)用等幾方面做了概括地介紹;從宿主的選擇,加速限速反應(yīng),改變代謝流和生產(chǎn)程序的優(yōu)化幾方面較為詳細(xì)地評(píng)述了代謝工程在苯丙氨酸基因工程菌構(gòu)建方面的應(yīng)用,并對(duì)代謝工程的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞代謝工程苯丙氨酸基因工程,等5報(bào)道的苯,經(jīng)過一些基因工程操作,50g/L。隨著代謝工程的發(fā)展,研究的熱點(diǎn)逐漸向產(chǎn)生新物質(zhì)及擴(kuò)展、構(gòu)建新代謝途徑方向轉(zhuǎn)移。人們將編碼抗生素的一些串聯(lián)基因進(jìn)行雜合、拼接,希望開發(fā)新型的抗生素,并獲得了成功;PHB(po

2、lyhydrox2ybutyrate)是細(xì)菌在生長受抑制時(shí),儲(chǔ)備過量碳源的1代謝工程發(fā)展?fàn)顩r重要分支。目前,定義,Bailey1:應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)細(xì)胞的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控功能進(jìn)行修飾,從而改善細(xì)胞的功能的技術(shù)。Cameron2認(rèn)為,代謝工程是有目的地對(duì)生化反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾的技術(shù)。代謝工程在工業(yè)微生物及生物途徑工程方面,常被定義為用重組DNA方法對(duì)中間代謝進(jìn)行有目的改造的技術(shù)。由于細(xì)胞中的代謝網(wǎng)絡(luò)是由數(shù)千種酶、膜傳遞系統(tǒng)、信號(hào)傳遞系統(tǒng)構(gòu)成,它們之間受到相互精密的調(diào)控,對(duì)代謝的影響決非單一因素所能左右,因此代謝工程一般為多基因的基因工程。它是隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展而興起的,并與生物化學(xué)、遺

3、傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生理生化、化學(xué)工程及系統(tǒng)分析等學(xué)科相互滲透,逐步趨于完善。111應(yīng)用概況多聚物,它可以被微生物降解。真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Al2caligeneseuthophus)可用不同的碳源前體物合成不同類型的多聚物,根據(jù)這個(gè)特點(diǎn),Peoples等6將它的產(chǎn)PHB的操縱子導(dǎo)入大腸桿菌中,產(chǎn)PHB可達(dá)細(xì)胞干重的50%,在植物中PHB也表達(dá)成功,盡管產(chǎn)量并不高,但為生產(chǎn)環(huán)保的一次性材料奠定了基礎(chǔ)。在環(huán)保中,另一個(gè)重要研究方向是將具有新的催化活性的基因?qū)爰賳伟?pseudomonas)或大腸桿菌,用來降解樟腦、水楊酸和苯甲酸鹽、氯代聯(lián)苯、三氯乙烷等苯環(huán)類化合物。另外,在不能利用纖維素的菌中導(dǎo)入

4、水解酶基因,使其分泌表達(dá),就實(shí)現(xiàn)了對(duì)多糖纖維素的利用,擴(kuò)大了適合宿主生長所需的底物范圍。此外,代謝工程在提高細(xì)胞耐受力方面的研究也取得進(jìn)展,抗鹽、抗旱、抗病原、抗毒素的基因都在細(xì)胞中得到了表達(dá),使細(xì)胞具有了新的表征特征。112代謝工程的研究方法代謝工程最早期的發(fā)展,就是從1974年Chakrabarty等3利用假單胞菌降解樟腦及萘的應(yīng)用開始的。目前在提高宿主細(xì)胞原有代謝物的產(chǎn)量、產(chǎn)生宿主本身不具有的新物質(zhì)、擴(kuò)展和構(gòu)建新代謝途徑等方面均有較大發(fā)展。宿主細(xì)胞固有的代謝產(chǎn)物包括細(xì)胞分解代謝產(chǎn)物、抗生素、維生素、氨基酸等。最常見的代謝工程應(yīng)用就是乙醇的生產(chǎn),Brau等4將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomon

5、asmobilis)的丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase)和乙醇脫氫酶(alchoholdehydrogenase)基因?qū)氪竽c桿菌和克雷伯氏菌(Klebsiella)中,大大地提高了乙醇的產(chǎn)量;抗生素生產(chǎn)菌種構(gòu)建的優(yōu)勢在于相關(guān)基因的成串排列,易于克隆和進(jìn)行調(diào)控改造,已經(jīng)開發(fā)了頭孢霉素等一系列產(chǎn)品,大量新產(chǎn)品正在被研制。對(duì)于隨著代謝工程與各種學(xué)科知識(shí)的融合,越來越多的研究方法和策略被應(yīng)用于代謝工程的研究。如利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建基因,改造物種;用生化分析及檢測手段來評(píng)價(jià)改造生物的功能。通過數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)手段模擬、設(shè)計(jì)及預(yù)測改造生物的功能。11211分子生物學(xué)方法構(gòu)建特殊的基

6、因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),尤其對(duì)于具有較高35生產(chǎn)價(jià)值的微生物,具有重要意義。例如在棒桿菌中,通過尋找土著質(zhì)粒,利用不同的啟動(dòng)子構(gòu)建特殊的載體,實(shí)現(xiàn)了外源基因在棒桿菌中表達(dá);Backman等利用切割載體獲得Tyr營養(yǎng)突變型,從而為構(gòu)建苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ);Andeeask等7應(yīng)用從Tn7發(fā)展的雙成分轉(zhuǎn)移系統(tǒng),將大腸桿菌的lacZY基因整合到銅綠假單胞菌染色體中,以保持助因子如何定義有所爭議。因?yàn)橛貌煌暾耐緩椒治鏊玫降膮?shù)推斷整個(gè)途徑的模式是不夠精確的。代謝的途徑十分復(fù)雜,而大多數(shù)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來自體外實(shí)驗(yàn),所以其精確度是有疑問的。近來,代謝網(wǎng)絡(luò)剛性的概念被用于評(píng)價(jià)體內(nèi)的代謝調(diào)控,并被人們越來越多地認(rèn)識(shí)

7、。2代謝工程在苯丙氨酸生物工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用克隆基因的穩(wěn)定。藍(lán)2黑標(biāo)記是人們構(gòu)建的追蹤和分析代謝途徑的標(biāo)記。隨著從增加已有蛋白的產(chǎn)量向構(gòu)建新的代謝途徑研究的轉(zhuǎn)移,越來越多的新工具將會(huì)被應(yīng)用。11212分析化學(xué)及檢測方法苯丙氨酸在甜味二肽和腸內(nèi)腸外營養(yǎng)制劑及醫(yī)藥中有著廣泛的應(yīng)用。在對(duì)其生物合成途徑廣泛研究的基礎(chǔ)上,代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑,因此必須對(duì)。的分析通路阻斷的手段有:段,而核磁共振、發(fā)展增添了新的活力。11213數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)工具在選擇宿主微生物時(shí),需要考慮以下因素:克隆載體和克隆的可能性、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移及重組的可能性、環(huán)境污染、中間產(chǎn)物的獲得、應(yīng)用原料的范圍,宿主生理學(xué)和遺傳背景等。綜合考

8、慮以上因素,大腸桿菌是首選,它是能利用簡單培養(yǎng)基快速生長的菌株。人們對(duì)大腸桿菌中苯丙氨酸生物合成、遺傳學(xué)、生理學(xué)及酶學(xué)方面也有較深入的研究,并且在做遺傳改造時(shí),其生長率不受影響。另外,隨著人們對(duì)棒狀桿菌研究的深入及載體受體系統(tǒng)的建立,這種傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)菌株也日益受到關(guān)注。212加速限速反應(yīng)研究代謝工程不僅需要遺傳學(xué)知識(shí),而且需要對(duì)宿主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的了解,所以有效地將DNA數(shù)據(jù)庫的信息應(yīng)用于代謝工程并開發(fā)出適合的軟件系統(tǒng),是有一定難度的。1990年,Mavrovouniots等創(chuàng)造了一種在溶液中估算基本Gibbs能量的方法,Karp等構(gòu)建了981個(gè)生命體化合物數(shù)據(jù)庫,為未來的

9、發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。但是,細(xì)胞是一個(gè)完整的有機(jī)體系,即使計(jì)算最大代謝產(chǎn)物量這種簡單的計(jì)算,完成起來也比較困難,途徑中的結(jié)構(gòu)與拓?fù)淅碚搶?duì)產(chǎn)量的影響很大,人們在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合數(shù)學(xué)和化學(xué)的理論,發(fā)展了一些人工智能程序。以化學(xué)計(jì)量學(xué)為基礎(chǔ),Seressiotis和Bailety8推出MPS(metabolicPathwaySynthesis)體系,可系統(tǒng)地構(gòu)建生化途徑,從而推測出所有從底物到產(chǎn)物可能的途徑,但是沒有考慮到輔助因子的影響;Mavrovouniots9等利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)生化途徑,苯丙氨酸是由糖代謝中間產(chǎn)物42磷酸赤蘚糖與磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)過一系列反應(yīng)合成的,大部分的途徑與Tyr和Trp的

10、合成途徑一致。苯丙氨酸的合成在許多關(guān)鍵點(diǎn)上受到調(diào)控,調(diào)控的途徑多種多樣,第一步被三個(gè)同功酶催化,這三種酶分別通過轉(zhuǎn)錄途徑被產(chǎn)物所調(diào)控,酶的活性也受到產(chǎn)物的反饋抑制。這三個(gè)酶分別由aroF,aroG,aroH基因所編碼,分別受Tyr,phe和Trp調(diào)控;合成苯丙氨酸的第二、第三個(gè)關(guān)鍵酶是由pheA基因編碼的CM/PD酶,它在酶生成水平和酶的活力上受到產(chǎn)物的調(diào)控?？赏ㄟ^關(guān)鍵酶基因的克隆表達(dá)和去除產(chǎn)物苯丙氨酸的反饋抑制雙重手段加速限速反應(yīng)。關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá):在大腸桿菌和棒狀桿菌中,目前重點(diǎn)研究的關(guān)鍵酶有以下幾種:苯丙氨酸氨解酶(phenylalanineammonialysePAL)、DAHP

11、合成酶(DSDAHPsynthetase)、分枝酸變位酶(CMchorismatemutase)、預(yù)苯酸脫水酶(PDprephenatedehydratase)、氨基轉(zhuǎn)移酶(transaminase)。1985年,Ozaki等10把一株抗苯丙氨酸類似物的生產(chǎn)菌株棒將計(jì)算的最大理論產(chǎn)量與代謝途徑中許多因素相結(jié)合,并在多個(gè)化學(xué)計(jì)量學(xué)因子的限定下,模擬出從底物到產(chǎn)物的可能途徑。以動(dòng)力學(xué)參數(shù)為基礎(chǔ),對(duì)于動(dòng)力學(xué)因素的影響,已有近20年的研究歷史。七十年代發(fā)展的BST(BiochemicalSystemTheory)及MCT(MetabolicControlTheory)都是將特定途徑中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為

12、數(shù)學(xué)模型來進(jìn)行預(yù)測,但對(duì)其中用到的控制輔36狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)K38染色體上的CM和PD基因克隆進(jìn)質(zhì)粒pCE53中,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)回親株,苯丙氨酸的產(chǎn)量達(dá)到19g/l,比親株提高50%,Robinson等11從E.coliB菌株克隆了高效的轉(zhuǎn)氨酶基因,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)回親株,其芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性為親株的10倍;1992年,Ikeda等12從苯丙氨酸生產(chǎn)菌株中克隆了脫酶的DS、CM及PD酶基因,并將它們串聯(lián)起來,克隆到同一個(gè)多拷貝的載體上,轉(zhuǎn)移到色氨酸生產(chǎn)菌株中,使代謝流向產(chǎn)苯丙氨酸方向轉(zhuǎn)移,產(chǎn)酸28g/l;1993年,Ikeda等13代謝過程的關(guān)鍵分支

13、點(diǎn)。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是各個(gè)酶系競爭的對(duì)象:丙酮酸激酶(PYK)將PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸,PEP羧化酶、PEP羧激酶將PEP和CO2轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,DAHP合成酶將PEP和42磷酸赤蘚糖合成32脫氧222阿拉伯庚酮糖272磷酸(DAHP)。Gulber等16在研究PYK的功能時(shí),根據(jù)蛋白N端序列合成引物,得到126bp的片段,用同源重組的方法使PYK基因失活,盡量減少PEP流向丙酮酸生成的方向,為DAHP的合成提供更多的原料。21312,獲得了Tyr將完整的基因克隆入穿梭載體中,并導(dǎo)入棒狀桿菌中表達(dá),實(shí)現(xiàn)了利用異源的酶在棒狀桿菌中生產(chǎn)苯丙氨酸,產(chǎn)量23g/l。去除產(chǎn)物苯丙氨酸的反饋抑制:段

14、,控。因?yàn)榕c苯丙氨酸生物合成相關(guān)的許多基因都受到TyrR基因編碼的阻遏蛋白的調(diào)控,Yang等14通過構(gòu)建了多種TyrR的突變子,并將它們導(dǎo)入生產(chǎn)菌株,從而導(dǎo)致aroF,aroG,aroL和與苯丙氨酸運(yùn)輸和轉(zhuǎn)氨基作用有關(guān)的基因等不受抑制調(diào)控,而變?yōu)榻M成型表達(dá)。pheA基因同樣在基因表達(dá)水平受到調(diào)控,而且對(duì)它的調(diào)控是多方面的。它的啟動(dòng)子受到與苯丙氨酸相作用的特異性抑制蛋白的作用,對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。此外,還有一個(gè)前導(dǎo)的衰減子序列,在RNA轉(zhuǎn)錄的延伸過程中,根據(jù)苯丙氨酸的濃度,對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。鑒于調(diào)控的復(fù)雜性,人們試圖為pheA基因換一個(gè)新的啟動(dòng)子,而不去逐個(gè)地研究調(diào)控點(diǎn)。經(jīng)過許多分子操作,去除了

15、pheA中與調(diào)控有關(guān)的部分,將剩余的結(jié)構(gòu)基因與新的啟動(dòng)子相連,結(jié)果表明pheA基因的表達(dá)水平與所連接的啟動(dòng)子的性質(zhì)有很大的關(guān)系,連接的位置也是十分關(guān)鍵的。隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)與生物信息學(xué)的發(fā)展,對(duì)pheA基因編碼的雙功能酶CM/PD受苯丙氨酸反饋抑制的機(jī)理有了更深入的研究,Zhang等15將酶的三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域作了缺失突變分析,發(fā)現(xiàn)調(diào)控結(jié)構(gòu)域(286-386aa)缺失后,解除了苯丙氨酸的反饋抑制,但也影響了CM酶與分支酸的結(jié)合能力。213改變代謝流21311共同途徑上代謝前體物的積累。)下,又可以從,(42,這種方法的應(yīng)用,為獲得營養(yǎng)缺陷型提供了條件。應(yīng)用這種營養(yǎng)缺陷型,可使代謝支路的中間體預(yù)苯酸

16、不流向Tyr生成的方向,使苯丙氨酸的合成有充足的原料。21313構(gòu)建代謝旁路用代謝工程的方法可阻斷或降低副產(chǎn)物的合成。乙酸是大腸桿菌糖代謝的一個(gè)終末產(chǎn)物,對(duì)大腸桿菌有毒,傳統(tǒng)上用控制糖流加速度、超濾等方法來控制發(fā)酵液中乙酸的濃度。近來,Aristidou等18將枯草桿菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大腸桿菌中,明顯改變糖代謝流,使乙酸濃度保持在低于對(duì)細(xì)胞有毒害的水平。214生產(chǎn)程序的優(yōu)化構(gòu)建菌株和建立發(fā)酵程序的研究是相輔相成的。補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed2batch)的方式對(duì)生長最為有利。在發(fā)酵過程中需要不斷地加入碳源成分,以保持葡萄糖的濃度。Backman19等研究了一種培養(yǎng)基,不僅可以提高產(chǎn)量,還可以

17、減少下游分離的難度。加入氨水調(diào)節(jié)pH值,通入氧氣及加強(qiáng)攪拌都是必不可少的。研究表明,苯丙氨酸在對(duì)數(shù)生長期后開始產(chǎn)生,在穩(wěn)定期發(fā)生最大程度的積累,在容器中發(fā)酵36小時(shí),可產(chǎn)苯丙氨酸50g/L,它每消耗1g糖,可產(chǎn)出0125g苯丙氨酸,而且發(fā)酵幾乎沒有副產(chǎn)品。3對(duì)代謝工程的展望從1974年Chakrabarty的專利算起,代謝工程的發(fā)展僅有20年的歷史。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的豐富和發(fā)展以及對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的日益了解,代謝工程的內(nèi)容也更加豐富。但它的發(fā)展還很不成熟,不同37代謝途徑分為共同途徑和分支途徑,共同途徑為分支途徑提供前體物質(zhì);對(duì)共同途徑的研究在于學(xué)者對(duì)代謝工程仍有不同的定義。它是一個(gè)新生的研究領(lǐng)域

18、,在解決一個(gè)問題的同時(shí),又不斷遇到新的問題。例如,引入載體會(huì)導(dǎo)致宿主菌生長率、生長周期的調(diào)控、蛋白產(chǎn)量、碳源攝入等一系列的代謝變化。此外,導(dǎo)入氨芐青霉素抗性基因,會(huì)使宿主菌中產(chǎn)生2半乳糖酶,它在胞質(zhì)膜與宿主蛋白競爭,可能導(dǎo)致宿主生理功能障礙。在應(yīng)用代謝工程技術(shù)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的修飾過程中,把握修飾作用的強(qiáng)度是至關(guān)重要的。適度的修飾才能保證在不破壞細(xì)胞精細(xì)平衡狀態(tài)的同時(shí),獲得所需的代謝產(chǎn)物。諸如此類的問題為代謝工程的發(fā)展提出了更多的挑戰(zhàn)。盡管在研究過程中有很多懸而未決的問題,但苯丙氨酸生物工程菌構(gòu)建的成功是令人鼓舞的。代力。隨著研究的深入,越來越顯得重要法的應(yīng)用,代謝工程為發(fā)展更為復(fù)雜的組織工程、基因

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