免疫熒光組織化學技術(shù)

1、免疫熒光組織化學技術(shù)免疫熒光組織化學技術(shù)一、免疫熒光組織化學技術(shù)的發(fā)展史概述二、免疫熒光組織化學的原理（一）直接方法1.檢查抗原方法2.檢查抗體方法（二）間接方法1.檢查抗體夾心法方法2.檢查抗體方法3.檢查抗原法（三）補體法1.直接檢查組織內(nèi)免疫復合物方法2.間接檢查組織內(nèi)抗原方法（四）雙重免疫熒光組織化學標記方法（五）對照試驗1.直接方法2.間接方法3.補體方法三、熒光抗體的制備（一）熒光素1.異硫匐酸熒光素2.四甲基異硫匐酸羅達明3.得克薩斯紅Texasred4.其它熒光素（二）熒光素標記抗體的方法1.FITC標記抗體的方法2.四甲基異硫匐酸羅達明標記抗體方法3 .藻紅蛋白標記抗體方法4

2、.藍色熒光素標記抗體方法（三）熒光抗體的質(zhì)量控制1.染色特異性和敏感性的測定方法2.F/P比值的測定方法3.熒光抗體的保存四、免疫熒光組織化學染色方法（一）熒光抗體染色方法1.直接方法2.間接方法雙層法3.間接方法夾心法4 .補體方法5.膜抗原熒光抗體染色方法6.雙重染色方法7.熒光抗體再染色方法（二）熒光抗原染色方法五、熒光顯微鏡檢查方法（一）熒光和熒光顯微鏡（二）熒光顯微鏡標本制作要求1.載玻片2.蓋玻片3.標本4.封裱劑5.鏡油（三）使用熒光顯微鏡注意事項（四）熒光圖像的記錄方法六、非特異性染色的消除方法（一）非特異性染色的主要因素（二）消除非特異性染色的方法1.葡聚糖凝膠G-50柱層析

3、法2.DEAE纖維素柱層析法3.熒光抗體稀釋法4.純化抗原方法5.純化抗體方法免疫吸收方法6.伊文氏藍Evansblue襯染色方法七、現(xiàn)狀與展望免疫熒光組織化學技術(shù)一、免疫熒光組織化學技術(shù)的發(fā)展史概述免疫熒光組織化學是現(xiàn)代生物學和醫(yī)學中廣泛應用的技術(shù)之一， 是由Coons和他的同事1941建立，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細胞或組織化學。它與葡萄球菌A蛋白SPA、生物素與卵白素、植物血凝素ConA等相結(jié)合拓寬了領域；與激光技術(shù)、電子計算機，掃描電視和雙光子顯微鏡等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光組織化學技術(shù)；熒光激活細胞分類器Fluorescinactivatedcellsorter

4、FACS的應用，激光共聚焦顯微鏡的問世，使免疫熒光細胞技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領域。細胞顯微分光光度計與圖像分析儀的結(jié)合使免疫熒光組織化學的定量檢測更加準確。80年代到90年代相繼又有新的熒光素由現(xiàn)如R-藻紅骯,B-藻紅骯，C-藻青蛋白，cy2,cy3,cy5,cy7均在流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡中廣泛應用。由于免疫熒光組織化學的特異性，快速性和在細胞水平定位的準確性，已在免疫學、微生物學、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等許多方面得到廣泛應用，日益發(fā)揮重要的作用。二、免疫熒光組織化學的原理免疫熒光組織化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光

5、抗體或抗原作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原或抗體。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素， 熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)生明亮的熒光黃綠色或桔紅色，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量（圖3-2-1）。圖3-2-1紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學分直接法、間接法和補體法（一）直接方法1.檢查抗原方法

6、這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。（圖3-2-2）圖3-2-2直接法2.檢查抗體方法將抗原標記上熒光素，用此熒光抗原與細胞或組織內(nèi)相應抗體反應，而將抗體在原位檢測由來。（二）間接方法1.檢查抗體夾心法方法此法是先用特異性抗原與細胞或組織內(nèi)抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。2.檢查抗體方法用已知抗原細胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中莫種

7、抗原的抗體，抗體結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體抗種屬特異性IgG熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體反應，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。3.檢查抗原法此法是直接法的重要改進， 先用特異性抗體與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外， 它只需要制備一種種屬間接熒光抗體， 可以適用于同一種屬產(chǎn)生的多種第一抗體的標記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應用的技術(shù)。（三）補體法1.直接檢查組織內(nèi)免疫復合物方法

8、用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原-抗體-補體抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復合物上補體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。2.間接檢查組織內(nèi)抗原方法常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經(jīng)37c孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應，補體就結(jié)合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應，形成抗原-抗體-補體熒光抗體的復合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。（四）雙重免疫熒光組織化學標記方法在同一組織標本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法

9、，將兩種熒光抗體如抗A和抗B以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫匐酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。(五)對照試驗為了保證免疫熒光組織化學染色的準確性，排除莫些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以下對照試驗1.直接方法(1)標本自發(fā)熒光對照標本只加PBS或緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察組織內(nèi)如果有熒光，稱為自發(fā)熒光。(2)抑制試驗可分為二步方法和一步方法。1)一步抑制方法先將熒光抗體與過量未標記特異性抗體作等量混合，再加在標本上染色，結(jié)果應為陰性。2)二步抑制方法標本先加未標記的特

10、異性抗體，水洗后再加標記熒光抗體，結(jié)果應呈陰性或明顯減弱的熒光。(3)陽性對照用已知陽性標本做直接法免疫熒光組織化學染色，結(jié)果應呈陽性熒光。結(jié)果如對照1和2無熒光或弱熒光，3待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。2 .間接方法(1)自發(fā)熒光對照同直接法。(2)熒光抗體對照標本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。(3)抑制試驗同直接法。(4)陽性對照同直接法。結(jié)果如對照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對照和待檢標本呈陽性熒光則為特異性熒光。3.補體方法（1）自發(fā)熒光對照（2）熒光抗體對照（3）抑制試驗（4）補體對照取新鮮豚鼠血清110稀釋先作用標本，洗后再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。（5）抑

11、制試驗標本加滅活的第一抗體，再加110稀釋的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應為陰性。（6）陽性對照。（1）（5）結(jié)果陰性，6和待檢標本陽性時，則為特異性熒光。三、 熒光抗體的制備制備熒光抗體是免疫熒光組織化學的重要技術(shù)之一，制備特異性強和高效價的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高效價的抗體。（一）熒光素熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止?？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱熒光色素。目前主要常用于標記抗體的熒光色素如下1.異硫匐酸熒光素 （fluoresceinisothiocyanate,FITC） F

12、ITC是一種呈黃色粉末狀，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490495nm,最大發(fā)射光譜為520530nm,呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為389.4o（圖3-2-3）圖3-2-3FITC的分子結(jié)構(gòu)式在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫匐酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵結(jié)合，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上最多能標記1520個FITC分子。2 .四甲基異硫匐酸羅達明tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITCTMRITC是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸收光譜為550nm

13、,最大發(fā)射光譜620nm呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC。它可用于雙標記示蹤研究圖3-2-4o3.得克薩斯紅texasred得克薩斯紅是一種褐色粉末狀，易溶于有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，在4c下能保存2年以上，最大吸收光譜為590-595nm,最大發(fā)射光譜為620-630mm,共有四種結(jié)構(gòu)，常用的分子量為625.15圖3-2-5。圖3-2-4TMRITC的分子結(jié)構(gòu)式圖3-2-5Texasred的分子結(jié)構(gòu)式4.其它熒光素如4-乙酰胺-4-異硫匐酸-2-硫酸黃SITS7-氨基甲基香豆素AMC呈蘭色熒光；藻紅素Rphycoerythrin-R;花青Cyanine,Cy

14、2,Cy3,Cy5,Cy7等。（二）熒光素標記抗體的方法1.FITC標記抗體的方法（1）Marsshall氏法1）材料抗體溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫匐酸熒光素、1硫柳汞水溶液、三角燒瓶25-50ml、冰及冰槽或1000ml燒杯、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯500ml、pH7.2的0.01mol/LPBS葡聚糖凝膠G-25層析柱等。2）方法及步驟抗體的準備取適量已知抗體濃度之溶液，加入三角燒瓶中，再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后抗體濃度為20mg/ml,碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10,混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌速度適當以不起泡

15、沫為宜510min。熒光素的準備根據(jù)標記的抗體總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱取所需的異硫匐酸熒光素粉末。結(jié)合邊攪拌邊將稱取的熒光素漸漸加入抗體溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上大約在510min內(nèi)加完， 加完后， 在4c左右繼續(xù)攪拌1218h,通常將裝置安放4c冰箱或冰庫中進行。透析結(jié)合完畢后，將標記的抗體溶液離心2000r/min10min,除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中再置于燒杯中用0.01MpH7.2緩沖鹽水透析04c過夜過柱取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。(圖3-2-6,圖3-

16、2-7)圖3-2-6SephadexG-25對FITC標記抗體液羊抗兔柱層析洗脫模型圖3-2-7FITC與家兔IgG球蛋白在25c和2c時結(jié)合的動力學Kawamura1964(2)Chadwick氏法1)試劑和材料抗體球蛋白溶液、異硫匐酸熒光素、3重碳酸鈉水溶液、0.01mol/LpH8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶25ml、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、燒杯500ml透析袋、棉線、玻棒等。2)方法及步驟抗體準備用04c的pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將抗體蛋白溶液稀釋至濃度為3040mg/ml,置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。熒光素準備按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱取所

17、需之熒光素量，用3重碳酸鈉水溶液溶解。將準備的抗體與熒光素溶液等量混合，充分攪勻，在04c冰箱中結(jié)合1824ho透析和柱層析方法同Marshall氏法。(3)改 良 法試 劑1)0.01mol/LpH7.2PBS配 法NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸儲水中，校定pH至7.2。2)0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液配法取0.5mol/LNa2CO35.310ml加入0.5mol/LNaHCO34.290ml,混勻后，校定pH至9.0o3)3重碳酸鈉水溶液配法稱1.5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸播水中即成。方法及步驟取高效價的抗人球蛋白

18、兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水0.15mol/LNaCI及緩沖液0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3pH9.0稀釋使每ml內(nèi)含抗體10mg,緩沖液為總量的10,降溫至4C,加入異硫匐酸熒光素，蛋白熒光素80mg1mg,在04c下電磁攪拌1214h。然后用半飽和的硫酸鏤將標記球蛋沉淀分離， 除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸鏤用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01,分裝在1ml安甑中， 或凍干，保存于冰箱中4c可以用半年以上，-20保存可達2年以上。4).四甲基異硫匐酸羅達明標記抗體方法(1)取IgG10ml6mg/

19、ml在0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。(2)將四甲基異硫匐酸羅達明每毫克IgG加入520mg溶于二甲亞碉1mg/ml,取此溶液300ml,一滴一滴加入抗體溶液中，同時電磁攪拌。(3)在室溫中攪拌2h,避光。(4)把結(jié)合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio-GelP-6層析柱，用0.01mol/LpH8.0的PBS平衡過柱，流速為1.5ml/min。(5)收集先流生的紅色結(jié)合物，即為標記抗體，分裝，4C保存?zhèn)溆谩?.藻紅蛋白標記抗體方法(1)疏基化藻紅蛋白phycoerthrin,PE的制備600以 1 的15.5mg/ml鹽酸端醇亞胺iminothiolanehydroc

20、hloride力口至U1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2mlPBpH6.8混合，裝入透析袋置入50mmol/LpH6.8PB中透析，4c過夜，再換用pH7.5PB透析6ho每個PE分子中可結(jié)合8個航基。(2)航基PE-IgG制備異雙功能試劑SPDPN-Succinimdyl3-2-pyridyldithiopropionate30mg1.1mg/ml的 乙醇溶液，加入700以的4.2mg/mlIgGPB溶液50mmol/LpH7.5,在室溫中反應2.5h。再加入航基化PE400以l1.7mg/ml加到500以 1 反應混合液中，室溫反應12h,加入100以 1 的50mmol/L碘

21、乙酸鈉封閉殘余端基，在4c用PB透析過夜。加入0.01NaN3分裝，4c保存半年。(3)PE-標記蛋白A方法1)取4.08mgPE溶于0.1mol/LpH7.4PB含0.1mol/LNaCl1ml中，溶解后，取由0.5ml,再加入10以lSPDP無水甲醇液2.6mg/ml,SPDP/蛋白摩爾比為10,22c反 應5min, 過SephadexG-50117cm， 用100mmol/LpH7.4PBS含0.1mol/LNaCl平衡和洗脫。2)0.5ml蛋白2mg/ml100mmol/LPBS含有100mmol/LNaClpH7.4,加入2.6以上述SPDP甲醇液，SPDP蛋白A95,22C,40

22、min,加入25以1二硫蘇糖醇DTTpH7.4緩沖液，22C,25min,同上過sephadexG-25,收集蛋白A峰。3)取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22c反應6h,混合物4c保存?zhèn)溆?，以上兩種PE標記制品，可最后溶于0.01mol/LpH7.4PB含有0.1mol/LEDTA、1mol/L碘乙酰胺、1BAS和0.1NaN3,04c保存。4.藍色熒光素標記抗體方法Kbaffan等1986首先創(chuàng)立了藍色熒光素標記和染色技術(shù)，可進行雙標記或多標記。(1)取7-氨基-甲基香豆素7-amino-4-methylcoumarin,AMC260以溶于二甲亞碉25以中。(

23、2)將上液加入10mlIgG-巴比妥緩沖液0.5mol/L,pH8.5，內(nèi)含50100mgIgG中，室溫反應2h,過SephadexG-50除去游離熒光素，最大熒光波長430nm,最大吸收波長354nm。(三)熒光抗體的質(zhì)量控制1.染色特異性和敏感性的測定方法(1)特異性染色和效價測定直接染色效價以倍比稀釋熒光抗體溶液如12,14,18,與相應抗原標本作一系列染色，熒光強度在“的最大稀釋度，為其染色滴度效價或單位。實際染色應用時， 可取低一個或兩個稀釋度即24個單位,如染色效價為164,實際應用時可取132或116。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法步驟， 先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以

24、抗核抗體熒光強度”為標準,染色用效價和直接法相同。(2)非特異性染色測定根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標本上由現(xiàn)的非特異染色應顯著低于特異染色，否則應采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。(3)吸收試驗在熒光抗體中加入過量相應抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4c中過夜，3000r/min,離心30min,收集上清液，再用于相應抗原陽性標本染色，結(jié)果應不由現(xiàn)明顯陽性熒光。2.F/P比值的測定方法F熒光素和P抗體蛋白的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為12。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏

25、感性。1 1)蛋白質(zhì)定量測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。22)結(jié)合熒光素定量先制作熒光素定量標準曲線，即準確稱取FITC1mg,溶于10ml0.5mol/LpH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/LpH7.2PBS稀釋到100ml,此時熒光素含量為10以g/ml,以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD）,以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫座標，作標準函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93-495nm,RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。F/P比值的計算可按以下公

26、式計算。FITCmg/ml160000103FITCmg/mlF/P克 分 子 比 值0.41蛋 白 質(zhì)mg/ml390106蛋白質(zhì)mg/ml式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103,而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下RB200mg/ml10-3580RB200熒光抗體的克分子比值蛋白質(zhì)mg/mlF60000IgGA515nmOD160000TMRITC熒光抗體克分子量比值或重量比g/gA280nmOD5803.熒光抗體的保存以04c或-20C低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。最好加入

27、濃度為15000的硫柳汞或者110000,疊氮納防腐，小量分裝如0.11ml,真空干燥后更易長期保存。四、免疫熒光組織化學染色方法（一）標本制作（二）熒光抗體染色方法1.直接方法（1）染色切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如18或116的熒光抗體，在室溫或37c染色30min,切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。（2）洗片傾去熒光抗體，將切片浸入pH7.2PBS中洗兩次，電磁振動，每次5min,再用蒸儲水洗1min,除去鹽結(jié)晶。（3） 50緩沖0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.09.5甘油封固、 鏡檢。直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和

28、研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原， 特異性高而敏感性較低。3 .間接方法雙層法（1）切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上， 置于染色盒中保持一定的濕度，37c作用30min。然后用0.01mol/LpH7.2PBS洗兩次，10min,用吸水紙吸去多余的液體。（2）再滴加間接熒光抗體如兔抗人丫球蛋白熒光抗體等，同上步驟，染色30min,37C,緩沖鹽水洗兩次10min,振動，緩沖甘油封固，鏡檢。4 .間接方法夾心法(1)切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。(2)滴加未標記的特異性抗原作用切片于37C,30min。(3)緩沖鹽水洗2次，每次5min,吹干。(4)滴加特異

29、性熒光抗體在切片上37C,30min。(5)如(3)水洗。(6)緩沖甘油封固，鏡檢。5 .補體方法(1)材料和試劑1)免疫血清60c滅活20min,用Kolmers鹽水作2倍稀釋成12,14,18。補體用110稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結(jié)合的效價如為132則免疫血清應用18稀釋。2)補體用新鮮豚鼠血清一般作110稀釋或按補體結(jié)合反應試管法所測定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法即在pH7.4的0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量為0.01濃度。3)抗補體熒光抗體在免疫血清效價為14,補體為2單位的條件

30、下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價14的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。（2）方法步驟1）涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次，3min,吹至組織表面無水份。2）吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清及補體的等量混合液此時免疫血清及補體又都各稀釋一倍滴于切片上，37C作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌或振動，每次5min,吸干標本周圍水份。4）滴加經(jīng)過適當稀釋的抗補體熒光抗體30min,37C,水洗同3。5）蒸播水洗1min,緩沖甘油封固。6 .膜抗原熒光抗體染色方法本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內(nèi)進

31、行染色，常用于T和B細胞、細胞培養(yǎng)物、瘤細胞抗原和受體等的研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS即采用此原理和方法。7 .雙重染色方法在同一標本上有兩種抗原需要同時顯示如A抗原和B抗原，A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法（1）一步法雙染色方法先將兩種標記抗體按適當比例混合AB,按直接方法進行染色。（2）二步法雙染色方法先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標記的A抗體染色，按間接法進行。結(jié)果A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。（三）熒光抗原染色方法莫些抗原可以用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。

32、用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接方法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。五、熒光顯微鏡檢查方法（一）熒光顯微鏡熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的基本工具，分透謝和落射二種類型，落射光無需鏡內(nèi)操作方便，效果更好。它是由超高壓光源、 濾板系統(tǒng)包括激發(fā)和壓制濾板和光學系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光， 通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像。（二）熒光顯微鏡標本制作要求1.載玻片載玻片厚度應在0.8-1.2mm之間，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚焦。載玻片必須光潔，厚度

33、均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。2 .蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光， 也可用干涉蓋玻片， 這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)如氟化鎂的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光又可激發(fā)標本。3 .標本組織切片或其他標本不能太厚， 如太厚激發(fā)光大部消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)。另外， 細胞重疊或雜質(zhì)掩蓋， 背景非特異染色引起的熒光影響判斷。4.封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L,pH9.09.

34、5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。如果用抗褪色劑封裱熒光染色標本更有利于顯微攝影。配方是將P次苯基二胺二氫氯100mg加入PBS10m1中,調(diào)pH至9.09.5,再加入甘油90ml,混勻，在室溫放置過夜，待其中小氣泡完全消失即可使用。5 .鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時， 必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。對于落射光熒光顯微鏡BX60,NikonE-1000無須鏡油（三）使用熒光顯微鏡注意事項1.嚴格按照熒光顯微鏡由廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。2 .應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超

35、高壓汞燈515min,待光源發(fā)生強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。3 .防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應戴上防護眼鏡。4 .檢查時間每次以12h為宜，超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射35min后,熒光也明顯減弱或褪色；所以最多不得超過23ho5 .熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時， 應加電扇散熱降溫， 新?lián)Q燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數(shù)次點燃光源。6 .標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4c保存，可延緩熒光

36、減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。7 .熒光亮度的判斷標準一般為四級，即“無或可見微弱自發(fā)熒光。“僅能見明確可見的熒光?！翱梢娪忻髁恋臒晒?。“可見耀眼的熒光。（四）熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標， 即憑工作者目力觀察， 作為一般定性觀察，基本上是可靠的。隨著技術(shù)科學的發(fā)展，采用細胞分光光度計，流式細胞儀，激光共聚焦顯微鏡和圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易減弱褪色，要及時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯

37、微鏡攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24o以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s,熒光亮度就有降低。有的熒光強度不夠，曝光速度太慢，只能用人工掌握曝光時間，將熒光圖像拍攝下來。研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微數(shù)碼相機攝影系統(tǒng)裝置，如Nikon公司2001年在我國推由了NikonE-1000全自動熒光顯微鏡配備有CoolCCD與計算機聯(lián)接將圖像采集在軟盤上再與彩色打印機連接直接打印照片。六、非特異性染色的消除方法（一）非特異性染色的主要因素組織的非特異性染色的機理很復雜，其產(chǎn)生的原因主要可分以下幾點1.一部分熒光素未與抗體結(jié)合

38、，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特異性染色。2 .抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素月尿蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。3 .除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原如Forssman氏抗原，可與組織中特異性抗原以外的相應抗原結(jié)合。4 .從組織中難以提純抗原性物質(zhì)， 所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。5 .抗體分子上標記的熒光素分子太多， 這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。6.熒光素不純，標本固定不當?shù)?。（二）消除非特異性染色的方法消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當?shù)姆椒ǎＳ?/p>

39、的方法有以下幾種1.透析法熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。(1)將標記完畢的熒光抗體液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。(2)浸人0.01mol/LpH7.2的PBS中懸于大于標記物體積約50100倍的PBS內(nèi)，在4c中透析，每日更換34次PBS,透析液中無熒光即可在熒光光源照射下。2.葡聚糖凝膠G-50柱層析法除去游離熒光素可用葡聚糖凝膠G-25或G-50柱層析方法， 加入熒光抗體1518ml按床體積的5%10%加樣，使其緩慢滲人柱內(nèi)，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留3040min,使游離熒光素充分進入

40、分子篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后， 熒光抗體即向下移行， 逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的距離界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出,分前、中、后三部分，收集中間部分，測F/P比值，合格者濃縮，分裝。如僅用小量熒光抗體，可用1cm20cm的層析柱，取2gSephadexG-50裝柱，即可過濾23.5ml熒光抗體。3.熒光抗體稀釋法先測定熒光抗體的特異性染色與非特異性染色效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。4.純化抗原方法用各

41、種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的最主要條件?，F(xiàn)代免疫化學技術(shù)免疫吸收法和柱層析法等提供了很大的可能性。5.伊文藍(Evanblue)襯染色方法用0.01伊文藍的0.01mol/LpH7.2PBS溶液稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應用。伊文藍一般配成1溶液， 保存于4C,用前再稀釋至0.01用以稀釋熒光抗體。6匕外，還可以用胰酶消化組織切片或用10牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。七、 現(xiàn)狀與展望免疫熒光組織化學技術(shù)經(jīng)過半個多世紀的不斷改進和創(chuàng)新，已成為現(xiàn)代研究生物和醫(yī)學的重要手段之一

42、。由于免疫熒光技術(shù)與形態(tài)、 機能相結(jié)合不斷完善和發(fā)展， 尤其是合成了多種新熒光素與抗體容易結(jié)合，結(jié)合物穩(wěn)定?？梢院虵ITC結(jié)合進行免疫熒光組織化學雙標記或三標記。至今，它已和親合化學技術(shù)如SPA,Biotin及avidin,ConA相結(jié)合，應用領域也日益擴大，又與現(xiàn)代的電子計算機和掃描電視技術(shù)，共聚焦顯微鏡，熒光激活細胞分類器（FACS）以及數(shù)碼相機攝影技術(shù)的應用，使得快速性、簡便性有了更大的提高，使得定量更加準確。90年代又開展了熒光原位末端標記和熒光原位雜交技術(shù)，使得范圍更廣大。雖然免疫組織化學有了很大的發(fā)展，如免疫金銀法，免疫膠體鐵法，SP,Evision和CSA法， 但由于它有自己獨特

43、的優(yōu)點， 特異性強，定位準確、簡便、快速、鮮明，在許多領域中仍占有不可取代的地位。如腎活檢、 皮膚活檢中IgG,IgM,IgA,C3等檢測， 自身抗體的檢查，傳染病的快速診斷，單克隆抗體的篩選及鑒定等。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展， 免疫熒光組織化學技術(shù)廣泛應用于生命科學的各個領域，放射由更加燦爛五彩繽紛的熒光。參考文獻1.Akivoshi.Kawamura,JR.Fluorescentantibodytechniquesandtheirapplication.UniversityofTokyoPress.19692.王伯法免疫熒光組織化學和熒光組織化學技術(shù)。第四軍醫(yī)大學科技資料增刊，1974;25

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