最全的動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1、常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法最全常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法目錄常見疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法 1目錄1常見ELISA操作方法 2亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒2豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒5豬瘟病毒抗體阻斷ELISA試驗(yàn) 11豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)13口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)方法（3ABC-I-ELISA） 15口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 17PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 21犬細(xì)小病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書23犬瘟熱病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書25常見PCR操作方法 27豬偽狂犬病毒PCR診斷試劑劑盒 27豬圓環(huán)病毒PCR斷試劑盒 30常見RT-PCR操作方法33口蹄疫病毒分子檢測(cè)診斷試劑盒

2、33H5亞型禽流感病毒RT-PCR僉測(cè)試劑盒說明書（20次）35新城疫病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒37豬瘟病毒RT-PC靜斷試劑盒 40凝集、血凝實(shí)驗(yàn)操作方法 43弓形蟲間接血凝試驗(yàn)（1HA）試劑使用說明書 43偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)試劑盒44豬細(xì)小病毒病乳膠凝集試驗(yàn)LAT診斷試劑盒使用說明書 45豬傳染性萎縮性鼻炎乳膠凝集試驗(yàn)LAT操作程序46豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)試劑使用說明書及實(shí)驗(yàn)操作程序 47口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn) 50高致病性禽流感血凝（HA和血凝抑制（HI）試驗(yàn)程序51瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 53雞馬立克氏病 53禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)55熒光抗體檢測(cè) 57豬瘟熒光抗體試驗(yàn)操作程序57對(duì)狂犬病

3、疑似動(dòng)物腦組織的直接免疫熒光（dFA）檢測(cè)58血清學(xué)診斷檢測(cè)常用試劑配方 60禽流感HA和HI試驗(yàn)用溶液的配制 60補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)63豬流感病毒H1亞型Hl試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清說明書 6366豬流感病毒RT-PCR僉測(cè) 豬瘟病毒RT-PC靜斷試劑盒豬繁殖與呼吸綜合癥（Nsp2 15941680變異株）RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)68一、布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清 71二、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)72動(dòng)物結(jié)核病診斷操作規(guī)程7334常見ELISA操作方法試劑盒內(nèi)含物.說明書.96 孔 ELISA 板.液體稀釋槽亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒亞洲1型口蹄疫陽(yáng)性對(duì)照血清（己稀釋濃度

4、為1:8）亞洲1型口蹄疫陰性對(duì)照血清3%雙氧水.U型96孔抗原抗體反應(yīng)板.封板膜.滅活亞洲I型口蹄疾病毒抗原.亞洲I型口蹄疫病毒兔抗血清.亞洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清25XPBST洗滌液（稀釋時(shí)準(zhǔn)確量?。?豚鼠抗血清稀釋液（用冰決包裹）終止液包被緩沖液（碳酸鹽）膠囊底物（檸檬酸-磷酸鹽）緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物OPD片劑二器材準(zhǔn)備（需用戶自備）1 .移液器：5- 50 口移液器、0.210 移液器、50200 口移液器、50300科1 12 道移液器各一把。2 .移液槍尖（若干）。3 .抗原抗體反應(yīng)板：微量血凝板（U型、V型均可）5塊，本試劑盒配備兩塊，用于被 檢血

5、清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注：抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用，實(shí)驗(yàn)后，用水沖洗干凈，然后用無離子水沸水浴 30秒，晾干，待用。4 .超純水，無離子水或蒸儲(chǔ)水。三、試劑準(zhǔn)備（需用戶完成）1 .包被緩沖液（PH9.6）將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開，將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4c存放,1月內(nèi)有效。2 .洗滌液（PBST）將本試劑盒配備的 25倍濃縮PBST液（可能有結(jié)晶形成，用時(shí)微熱溶化）用無離子 水或蒸儲(chǔ)水做1:25稀釋。（如果PH降低，務(wù)必用NaO戰(zhàn)至7.4）3 .底物溶液取1片檸檬酸一磷酸鹽片劑（本試劑盒配備）溶于100mL無離子水中，溶化后，取50mL 溶液，再加

6、1片鄰苯二胺（OPD）片劑，充分溶解，分裝（5mL/瓶或10Ml/瓶）,避光之- 20c保存。用前避光溶化，臨時(shí)每1mL上述溶液加10。本試劑盒配備的 3%的雙氧水（H202）。務(wù)必加雙氧水！四、操作步驟1.用包被緩沖液稀釋亞洲 1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（1:1000）, 在ELISA板上每孔加 50 口，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。2.抗原抗體（陰陽(yáng)性對(duì)照血清及待檢血清）反應(yīng)根據(jù)不同的需要，選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。圖1 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)10份樣品布局圖S11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32-1:41:161: 641:81:321:

7、1281:641: 2561:1281: 5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096圖1為抗體滴度測(cè)定（定量）檢測(cè)10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測(cè)定（定量）檢 測(cè)20份樣品布局圖。圖2 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1為例，在U型血凝板上按 50 /孔量用PBST將待檢血清從1:4開始

8、做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時(shí)，按圖示稀釋陰陽(yáng)性對(duì)照血清，然后每孔加入 50科1用 PBST稀釋到使用濃度的亞I洲型口蹄疫病毒抗原（1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原對(duì)照孔加100 口。振蕩混勻，封板,4 C過夜。加入病毒抗原后血清的稀 釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3.用洗滌液（1 X PBST）洗ELISA板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從 抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對(duì)應(yīng)孔，每孔50 口封板,37 C溫育1小時(shí)。4 .同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度（1:1000）, 每孔加50 口，封板,

9、37 C溫育1小時(shí)。5 .同上洗板5次,甩干。用1XPBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 （1:500）, 每孔加50 口封板,37 C溫育1小時(shí)。6 .同上洗板5次，每孔加50 口底物溶液（務(wù)必加雙氧水）,37 C溫育15分鐘。每孔再 加50 終止液終止反應(yīng)，立即在492nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值（OD92nm彳1）。五結(jié)果判定1 .試驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)每塊板設(shè)4孔病毒抗原對(duì)照，病毒抗原對(duì)照不加任何血清，直接用PBS而釋至使用 濃度，與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入 ELISA板孔,50科1/孔病毒抗原對(duì)照 OD492nm值 應(yīng)在1.5 0.5范圍內(nèi)。陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在 1:10241滴度以內(nèi)，陰性對(duì)

10、照血清抗體效價(jià)應(yīng)V 1:8。2 .病毒抗原對(duì)照平均 OD492nm值50%十算（臨界值）抗原對(duì)照是4孔，棄去最高和最低 OD492nm1,計(jì)算剩余2孔的平均OD492nn，再除以 2,即50%寸照值。該值即為臨界值，表示阻斷50版應(yīng)的對(duì)照OD492nmt。3 .結(jié)果判定以病毒抗原對(duì)照平均 OD492nm值白50私臨界值，被檢血清稀釋孔 OD492nm直大于臨 界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔的OD492nm直等于臨界值時(shí) 所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對(duì)照平均OD492nm直為1.2,則其50%; 0.60。若某一待檢血清在 1:128時(shí)OD492nm直

11、為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個(gè)滴度之間，如處于1 : 64與1: 128之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測(cè)中，兩個(gè)重復(fù)孔只要有一孔為陽(yáng)性孔，則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽(yáng)性孔，則判定 為抗體滴度1:128 。ELISA抗體效價(jià)1:128,判定為亞洲 1型口蹄疫抗體陽(yáng)性。ELISA抗體效價(jià)與保護(hù)力的關(guān)系：牛、羊：抗體效價(jià) 1:128,99% 保護(hù)；效價(jià)w 1:16, 不保護(hù)；效價(jià)在 1:22-90之間,50%保護(hù)。豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit（CSFVAg）概 述

12、豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）都是瘟病毒科黃病毒屬的成員。豬瘟病毒自從成為一種重要的病原體以來，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并引起豬的嚴(yán)重死亡。感染高致病力豬瘟病毒后，豬在出現(xiàn)臨床癥狀前會(huì)排出大量的病毒。耐過急性或亞急性感染的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會(huì)造成豬的隱性感染，病豬將會(huì)持續(xù)或間歇排出病毒直至死亡。懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性感染可能導(dǎo)致流產(chǎn)，木乃伊胎兒，死產(chǎn)和/或弱仔及畸形胎兒。先天性感染低毒力病毒的結(jié)果是產(chǎn)出持續(xù)性感染的仔豬，仔豬出現(xiàn)免疫耐受，不表現(xiàn)任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染 BVDV或BD

13、V。盡管這些感染通常呈溫和經(jīng)過并且是自限性的，但將 它們同豬瘟病毒有效區(qū)分是很重要的。原 理本ELISA檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)外周血白細(xì)胞、全血、細(xì)胞培養(yǎng)物以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原。采用雙抗體夾心ELISA ,將CSFV單克隆抗血清包被微量反應(yīng)板，可與樣品中的CSEV抗原結(jié)合。豬瘟病毒的特異性單克隆抗體形成了夾心的上層。形成的單克隆抗體+樣品+單克隆抗體夾心可以用辣根過氧化物酶標(biāo)記物檢測(cè)。加入與辣根過氧化物酶反應(yīng)的底物，在酶的作用下形成有色產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度?？梢杂?50nm單波長(zhǎng)或450nm與620m雙波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。試 劑本試劑盒采用96孔板，可以一次檢測(cè) 92個(gè)樣品（每個(gè)

14、樣品1孔，每個(gè)對(duì)照2孔）或46個(gè)樣品（每個(gè)樣品2孔，每個(gè)對(duì)照2孔）；或分6次使用，每次用2個(gè)板條，設(shè)2個(gè)對(duì)照，測(cè)定6個(gè)樣 品（每個(gè)樣品2孔）。為了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好每個(gè)樣本都設(shè)重復(fù)。試劑數(shù)量1、多克隆羊抗血清包被板條8孔X 12條（96孔）2、10倍濃縮樣品稀釋液（10x）55ml足以配制550mL直接使用的1x稀釋液3、10倍濃縮洗滌液（10x）125ml足以配制1、25L直接使用的洗滌液工作濃度 （1x）4、CSFV單克隆抗體，含防腐劑4ml5、陽(yáng)性對(duì)照，含有防腐劑1.5ml6、陰性對(duì)照，含有防腐劑1.5ml7、100倍濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記物 （100x）,辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠Ig

15、G ,含有防腐劑200 68、酶標(biāo)抗體稀釋液15ml9、底物液，TMB/H2O2溶液12ml10、終止液，1M HCI（小心，強(qiáng)酸）12ml注意事項(xiàng)1、仔細(xì)閱讀并遵守操作說明；2、試劑盒試劑于27c冷藏保存。建議將濃縮的洗滌液（10x）保存在1825c室溫,以免形成結(jié)晶。3、所有試劑在使用前必須恢復(fù)至室溫。4、未使用的包被板應(yīng)該密封保存在配備的塑料袋中，于27c冷藏保存。5、不要將不同批次的說明書以及試劑盒成分混合使用。6、注意防止真菌或細(xì)菌污染試劑盒成分。處理試劑時(shí)要小心。7、不要用超過保質(zhì)期的檢測(cè)試劑盒。8、進(jìn)行樣品或試劑操作時(shí)嚴(yán)禁吃東西、喝水或吸煙。9、每個(gè)樣品都用單獨(dú)的吸頭。10、每一

16、批次的試劑必須用其配備的陰陽(yáng)對(duì)照。11、配制試劑時(shí)只能用超純水。12、不要用嘴吸取液體。13、底物溶液和濃縮的樣本稀釋液對(duì)眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚有剌激性，避免與皮膚和眼睛接觸。14、終止液為1MHC1, HCI為強(qiáng)酸并且能造成灼傷，小心處理。15、本試劑盒只能用于體外診斷。獸醫(yī)專用。 試劑配制1、包被的反應(yīng)板、豬瘟病毒特異性單克隆抗體、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、底物溶液、終 止液為現(xiàn)用試劑。2、洗滌液10倍濃縮洗滌液必須用超純水或雙蒸水進(jìn)行10彳t（1: 10）稀釋，稀釋的洗滌液于 27c冷藏保存，但不能超過 3天；或冰凍保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀釋的洗滌液，將450ml超純水或雙

17、蒸水加到 50ml濃縮液中，混勻。注意：如果濃縮液有結(jié)晶，在 使用前必須溶解?？蓪⑵孔臃旁跍厮?0分鐘以上。3、樣品稀釋液10倍濃縮樣品稀釋液必須用超純水或雙蒸水進(jìn)行10倍（1 ： 10）稀釋，但如果檢測(cè)全血樣品時(shí)，將適量的10倍濃縮液與等體積的超純水混合，制成5倍濃縮液（5X）即可。將制備的稀釋液于27c冷藏保存，但不能超過 3天；或者冰凍保存，可以保存一年以上。4、辣根過氧化物酶標(biāo)記物 （100x）100彳H（100X）濃縮標(biāo)記物在使用前必須用標(biāo)記物稀釋液進(jìn)行1 ： 100倍稀釋。如果只使用部分試劑，只要用稀釋液按100倍（1 ： 100）稀釋足夠本次使用白標(biāo)記物濃縮液（旋渦振蕩混勾）即

18、可。稀釋后的標(biāo)記物溶液只能保存24小時(shí)。例如：10ml的辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液，只需取100 濃縮標(biāo)記物（100X）加到10ml標(biāo)記物稀釋液中，在旋渦振蕩器上混勻即可。 自備器材1、精密移液器，5科1至1000 d 12、一次性移液吸頭。3、雙蒸水或超純水。4、洗瓶或自動(dòng)洗板機(jī)。5、濕盒或封板膠帶。6、離心機(jī)，2000xg。7、酶標(biāo)儀。8、離心管和小試管。9、微量離心機(jī)，10, 000xg。10、旋渦振蕩器。11、剪刀和攝子。12、0.17MNH 4cI溶液,制備白細(xì)胞用。樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在27c保存7天，或-20C冷凍保存6個(gè)月以上。但這些樣品在應(yīng)用前應(yīng)該再次以 1,

19、 500xg離心10分鐘或10, 000xg離心25分鐘。外周血白細(xì)胞a）取10ml肝素或EDTA抗凝血樣品，1, 500xg離心1520分鐘。b）用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入 500科樣品稀釋液（1X）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時(shí)，其間不時(shí)用旋渦器混合。然后直接進(jìn)行步驟f操作；c）假如樣品的棕黃層壓積細(xì)胞體積非常少，那么就用整個(gè)細(xì)胞團(tuán)（包括紅細(xì)胞）。將細(xì)胞加進(jìn)10ml的離心管，并加入5ml預(yù)冷（27c ,下同）的0.17MNH 4CI（氯化?。┗靹?，靜置10 分鐘。d）用冷（27C）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1, 500xg離心5分鐘。e）棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)中

20、加入500科樣品稀釋液（1x）,用潔凈的吸頭懸起細(xì)胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。f） 1, 500xg離心5分鐘，取上清液按操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。g） 注意：處理好的樣品可以在 27c冷藏保存7天，或-20C冷凍保存6個(gè)月，但在使 用前必須再次離心。外周血自細(xì)胞（簡(jiǎn)化方法）a）取0.52ml肝素或EDTA抗凝血與等體積冷（2-8C）0.17M NH4CI加入離心管混合。室 溫放置10分鐘。b） 1, 500xg離心10分鐘（或10, 000xg離心23分鐘），棄掉上清。c）用冷（27C）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1, 500xg離心5分鐘。d）棄

21、去上清，向細(xì)胞團(tuán)中加入500科樣本稀釋液（1x）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置 1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。取75科胺照操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。全血（肝素或EDTA抗凝）a）取25 n10倍濃縮樣品稀釋液（10X）和475科隹血加入微量離心管，在旋渦振蕩器上混勻。b）室溫下溫育1小時(shí)，期間不時(shí)用旋渦器混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進(jìn) 行檢測(cè)?；颍褐苯訉?5科全血加入酶標(biāo)板孔中，再加入10口5倍濃縮樣品稀釋液（5X）?；蝿?dòng)酶標(biāo)板/板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)物a）移去細(xì)胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞加入到離心管中。b） 2, 500xg離心5分鐘,棄去上清。c）向細(xì)

22、胞團(tuán)中加入500科樣品稀釋液（1x）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)用旋渦器混合。取此樣品75 口按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于28c冷藏保存1個(gè)月。每只動(dòng)物檢測(cè)12種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。a）取12g組織用剪刀剪成小碎塊（25mm大小）。b） 將組織碎塊加入10ml離心管，加入5ml樣品稀釋液（1x）,旋渦振蕩混勻，室溫下放 置12小時(shí)，期間不時(shí)用旋渦器混合。c） 1, 500xg離心10分鐘，取75科比清液按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。 操作步驟注意：所有試劑在使用前應(yīng)該恢復(fù)至室溫1825C;使用前試劑應(yīng)在室

23、溫條件下至少d） 1小時(shí)。1、每孔加入25科1CSFV寺異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器（812道）操作。2、在相應(yīng)孔中分別加入 75科陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，各加 2孔。注意更換吸頭。3、在其余孔中分別加入 75科制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標(biāo)板，使樣品 混合均勻。4、置濕盒中或用膠條密封后室溫 （1825C）溫育過夜。也可以放置室溫溫育4個(gè)小時(shí)，但是這可降低檢測(cè)靈敏度。5、甩掉孔中液體，用洗滌液（1X）洗滌5次，每次洗滌都要將孔注滿。將孔中的所有液 體倒空，用力拍打酶標(biāo)板，以使所有液體拍出?；蛘?，每孔加入洗滌液 250300口用自動(dòng) 洗板機(jī)洗滌5次。注意：洗滌酶標(biāo)板要仔細(xì)細(xì)心。

24、6、每孔加入100 d稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記物，在濕盒或密封后置室溫溫育1小時(shí)。7、重復(fù)操作步驟5;每孔加入100科底物液，在暗處室溫溫育 10分鐘。第1孔加入底物 液開始計(jì)時(shí)。8、每孔加入100科終止液終止反應(yīng)。加入終止液的順序與上述加入底物的順序一致。9、在酶標(biāo)儀上測(cè)量樣品與對(duì)照孔在450m處的吸光值，或測(cè)量在 450nm和620nm雙波長(zhǎng)的吸光值（空氣調(diào)零）。10、計(jì)算每個(gè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的矯正吸光值的平均值（參見“計(jì)算方法”）。計(jì)算方法首先計(jì)算樣品和對(duì)照孔的 OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽(yáng)性對(duì)照孔的OD平均值必須進(jìn)行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽(yáng)性對(duì)照值減去陰性對(duì)照值。矯

25、正OD=樣本OD 陰性對(duì)照OD注意：北京愛德士元亨生物科技有限公司奮進(jìn)行平均值相UN值計(jì)算并提供數(shù)據(jù)匯總的儀器和軟件系統(tǒng)（xChek）試驗(yàn)有效性判定陽(yáng)性對(duì)照OD平均值應(yīng)該大于0.500,陰性對(duì)照OD平均值應(yīng)小于0.150,試驗(yàn)結(jié)果方能有 效。否則，應(yīng)仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作并進(jìn)行重測(cè)。如果陰性對(duì)照的吸收值始終很高，將陰性對(duì) 照液在微量離心機(jī)中10, 000xg離心35分鐘，重新檢測(cè)。結(jié)果判定被檢樣品的矯正吸光值大于或等于0.30,則為陽(yáng)性：被檢樣品的矯正吸光值小于 0.20,則為陰性；被檢樣品的矯正吸光值大于 0.20,小于0.30,則為可疑。建議根據(jù)外周血白細(xì)胞處理方案或細(xì)胞培養(yǎng)物處理方案進(jìn)行全血樣

26、品的處理和檢測(cè)。豬瘟病毒抗體阻斷ELISA試驗(yàn)本方法是用于檢測(cè)豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的一種阻斷ELISA方法，通過待測(cè)抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，采用辣根過氧化物酶與底物的顯色程度來進(jìn) 行判定。1 操作步驟在使用時(shí)，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫1825C。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫至少 1小時(shí)。1.1 分另將50uL樣品稀釋液加入每個(gè)檢測(cè)孔和對(duì)照孔中。1.2 分另將50uL的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照加入相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭要 更換，以防污染。1.3 分另將50uL的被檢樣品加入剩下的檢測(cè)孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防 污染。1.4 輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振

27、蕩，使反應(yīng)板中的溶液混勻。1.5 將微量反應(yīng)板用封條封閉置于濕箱中（1825C）孵育2小時(shí)，也可以將微量反應(yīng)板用封條置于濕箱中孵育過夜。1.6 吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時(shí)都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔。1.7 分另1J將100uL的抗CSFV1標(biāo)二抗（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板 并于室溫下或濕箱中孵育 30分鐘。1.8 洗板（見1.6）后，分別將100uL的底物溶液加入反應(yīng)孔中，于避光、室溫條件 下放置10分鐘。加完第一孔后即可計(jì)時(shí)。1.9 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入 100uL終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止 液。1.10 在450nm處測(cè)定樣

28、本以及對(duì)照的吸光值，也可用雙波長(zhǎng)（450nm和620nm）測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光度值，空氣調(diào)零。1.11 計(jì)算樣本和對(duì)照的平均吸光度值。計(jì)算方法如下：計(jì)算被檢樣本的平均值 OD450（= ODTEST、陽(yáng)性對(duì)照的平均值（= ODPOS陰性對(duì)照的平均值（= ODNE6根 據(jù)以下公式計(jì)算被檢樣本和陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率；ODNEG - ODTEST阻斷率= X100%ODNEG2試驗(yàn)有效性陰性對(duì)照的平均 OD450應(yīng)大于0.50。陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率應(yīng)大于 50% 3結(jié)果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40%,該樣本被判定為陽(yáng)性（有 CSFM體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%,該樣本被判定為陰

29、性（無CSFVt體存在）。如果被檢樣本阻斷率在 3040%之間，應(yīng)在數(shù)日后再對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行重測(cè)。豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（一）材料及試劑1 .豬瘟單抗純化抗原2 .兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體3 .豬瘟陽(yáng)性血清4 .豬瘟陰性血清14均由指定的生物制品所購(gòu)買。5 . ELISA反應(yīng)板6 .包被液碳酸鈉1.50g碳酸氫鈉2.93gH2O加至1 000mlpH值9.67 . PBS 液氯化鈉8.90g、磷酸二氫鉀 0.20g、無水磷酸氫二鈉 2.13g、加雙儲(chǔ)水 1 000ml8 . PBS 吐溫洗滌液、PBS液1 000ml、犢牛血清 5ml、混合即可9 .底物溶液0.1Mol/L檸檬酸液、檸檬酸 21g、

30、雙蒸儲(chǔ)水加至 1 000ml 0.2Mol/L Na2HPO4液、Na2HPO4 122O 71.6g、雙蒸儲(chǔ)水 加至 1 000mlpH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液取液24.30ml、液25.70ml混勻即可鄰苯二胺液取液50ml、雙儲(chǔ)水50ml、磷苯二胺20mg、30%H2O2 0.15mb待鄰苯二胺溶化后 再加H2O2,現(xiàn)用現(xiàn)配。10 .終止液濃 H2SO4（98%） 22.2ml、H2O 177.80ml（二）操作方法1 .用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原各做100倍稀釋，每孔包被100 d l , 4c濕盒過夜。2 .次日取出，甩去孔內(nèi)液體，3X3沖洗。3 .

31、將待檢血清以PBS液彳 400倍稀釋，每孔加100 口同時(shí)將豬瘟陽(yáng)性血清、豬瘟陰性血清各做100倍稀釋，于對(duì)照孔中加 100d l。37c溫育1.5h2h。4 .重復(fù)第二步，取出，甩去孔內(nèi)液體，3X3洗滌。5 .將兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體以PBS液彳1 100倍稀釋，每孔加100口，37c溫育1.5h 2h。6 .重復(fù)第4步。7 .每孔加底物溶液100d l ,室溫下觀察顯色反應(yīng)。當(dāng)陰性對(duì)照孔稍顯色時(shí)，立即終止 反應(yīng)，并以陰性孔做空白對(duì)照。8 .每孔加終止液50 口立即于酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的光密度。（三）結(jié)果判定在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上，OA 0.2,為豬瘟弱毒抗體陽(yáng)性；ODX 0.2

32、,為豬瘟弱毒抗體陰性。在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上，OA 0.5,為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽(yáng)性；OEX 0.2,為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)方法(3ABC-I-ELISA)簡(jiǎn)介口蹄疫(FMD)是一種高度接觸性傳染病，傳播迅速，可形成世界性大流行，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和國(guó)際畜產(chǎn)品貿(mào)易具有嚴(yán)重的負(fù)面影響?？刂坪拖麥鏔M睬略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的國(guó)家，大多數(shù)動(dòng)物血清口蹄疫病毒(FMDV用構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原(VIAA,即3D)抗體均為陽(yáng)性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和VIAA的診斷方法很難確定口問疫病毒感染與否。只有將感染動(dòng)物和隱性帶毒動(dòng)物與疫苗免疫動(dòng)物加以區(qū) 分才能為FMD勺控制和消滅提供科學(xué)的依據(jù)。日前

33、的疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中 去除絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動(dòng)物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，而自然感染動(dòng)物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體，也有非結(jié)構(gòu)蛋向3AB%體。因此檢測(cè)FMDVjE結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測(cè)隱性感染動(dòng)物，而且可以區(qū)分感染 動(dòng)物和免疫動(dòng)物?？谔阋卟《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒(FMD3ABC-I-EL1SA)對(duì)感染牛的檢出率很高，敏感性在99艱上。對(duì)免疫牛的特異性在 96%A上。用途FMD3ABC-I-ELISA試劑盒檢測(cè)FMDVfE結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。該試劑盒不受血清型影響， 適用于活畜進(jìn)出口調(diào)運(yùn)、疫區(qū)凈化檢疫和群體無癥狀感染評(píng)價(jià)，區(qū)分

34、感染和免疫動(dòng)物。原理FMD3ABC-I-ELISA試劑盒采用間接 ELISA模式。用3ABCg因表達(dá)蛋白（Ag）包被ELISA板，洗板封閉。檢測(cè)時(shí)，加入待檢血清樣品，如果血清樣品中有3AB%體，與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物后，就會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)。如果待檢樣品為陰性，就不能形成抗原-抗體復(fù)合物，酶標(biāo)二抗不會(huì)結(jié)合，因此就不顯色。注意事項(xiàng)1 .冰凍血清樣品應(yīng)充分融化，且應(yīng)混和均勻。2 .血清稀釋液和底物應(yīng)平衡至室溫應(yīng)用。底物A在4c為結(jié)晶狀態(tài)，需要在室溫或37 c水浴化開后應(yīng)用。3 .最好在血清稀釋板上稀釋血清，以減小操作誤差。4 .應(yīng)使用相同的加

35、樣器加樣，以保證加樣量的準(zhǔn)確，減小試驗(yàn)誤差。5 .多道微量移液器所用的吸頭應(yīng)為同一規(guī)格和型號(hào)，避免加樣誤差。6 .應(yīng)使用自動(dòng)或手動(dòng)連續(xù)洗板系統(tǒng)洗板。7 .加樣先后次序應(yīng)該一致，保證作用時(shí)間一樣。8 .底物作用時(shí)間到后，如果顏色較淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間。9 .本試劑盒只能檢測(cè)一種動(dòng)物的血清樣本，應(yīng)分別訂購(gòu)檢測(cè)牛、豬或羊血清的試劑 盒，以測(cè)定不同動(dòng)物來源的血清。試劑準(zhǔn)備1.洗滌液（PBST）將試劑盒配備的25倍濃縮PBST用無離子水或蒸儲(chǔ)水做1:25倍稀釋即可。操作步驟1 .待檢血清樣品和陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清用血清稀釋液1:21倍稀釋（120血清稀釋液加血清6L）,每孔加入lOOp L,陰、陽(yáng)性對(duì)照

36、血清平行加兩孔，用封口膜封口，37 c結(jié)合30分鐘。2 .取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。3 .用血清稀釋液按l:lOO比例稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100 L,用封口膜封口，37 c結(jié)合30分鐘。4 .取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。5 .將底物A按1:50比例（體積比）稀釋于底物B中（lmL底物B中加入20dL底物A）,吹打 混勻，每孔加入100d L,封口膜封口，37c避光作用 1015分鐘。6 .每孔加入.1001終止液。7 .輕輕搖振混勻，測(cè)定波長(zhǎng) 450nm吸光值（OD450nm直）。8 .陽(yáng)性對(duì)照平均OD值應(yīng)大于0.6 ;陰性對(duì)照平均 OD

37、直應(yīng)小于0.2。9 .結(jié)果計(jì)算：樣品效價(jià)為:（OD樣品-OD陰性）+ （OD陽(yáng)性-OD陰性）。結(jié)果判定若效價(jià)0.2,為陰性；效價(jià)在 0.20.3之間為可疑；效價(jià)0.3為陽(yáng)性?？梢珊完?yáng)性 樣品應(yīng)進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)為可疑或者陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)判為陽(yáng)性。96孔酹機(jī)板你局圖ARCD E F G,性_ 11國(guó)出匚_ 1 I HittT . J對(duì)性J_1L L一一 11 ,ir口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒內(nèi)含物.說明書.96 孔 ELISA 板.液體稀釋槽亞洲1型口蹄疫陽(yáng)性對(duì)照血清（己稀釋濃度為1:8）亞洲1型口蹄疫陰性對(duì)照血清3%雙氧水.U型96孔抗原抗體反應(yīng)板25XPBST洗滌液（稀釋時(shí)準(zhǔn)確量取）.

38、封板膜豚鼠抗血清稀釋液.滅活亞洲I型口蹄疾病毒抗原（用冰決包裹）終止液.亞洲I型口蹄疫病毒兔抗血清包被緩沖液（碳酸鹽）膠囊.亞洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物（檸檬酸-磷酸鹽）緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物OPD片劑器材準(zhǔn)備（需用戶自備）1 .移液器：5- 50 口移液器、0.210 移液器、50200 口移液器、50300科1 12道移液器各一把。2 .移液槍尖（若干）。3 .抗原抗體反應(yīng)板：微量血凝板（U型、V型均可）5塊，本試劑盒配備兩塊，用于被 檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注：抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用，實(shí)驗(yàn)后，用水沖洗干凈，然后用無離子水沸水浴 30秒，晾干，待用。

39、4 .超純水,無離子水或蒸儲(chǔ)水。三、試劑準(zhǔn)備（需用戶完成）1 .包被緩沖液（PH9.6）將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開，將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4c存放,1月內(nèi)有效。2 .洗滌液（PBST）將本試劑盒配備的 25倍濃縮PBST液（可能有結(jié)晶形成，用時(shí)微熱溶化）用無離子 水或蒸儲(chǔ)水做1:25稀釋。（如果PH降低，務(wù)必用NaOH至7.4）3 .底物溶液取1片檸檬酸一磷酸鹽片劑（本試劑盒配備）溶于100mL無離子水中，溶化后，取50mL 溶液，再加1片鄰苯二胺（OPD）片劑，充分溶解，分裝（5mL/瓶或10Ml/瓶），避光之- 20c保存。用前避光溶化，臨時(shí)每1m

40、L上述溶液加10。本試劑盒配備的 3%的雙氧水（H202）。務(wù)必加雙氧水。四、操作步驟1 .用包被緩沖液稀釋亞洲 1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（1:1000）, 在ELISA板上每孔加 50 口，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。2 .抗原抗體（陰陽(yáng)性對(duì)照血清及待檢血清）反應(yīng)根據(jù)不同的需要，選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。圖1 96孔酶標(biāo)板檢測(cè) 10份樣品布局圖S11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32-1:41:161: 641:81:321: 1281:641: 2561:1281: 5121:2561:10241:5121:20481:l0241:40

41、96圖1為抗體滴度測(cè)定（定量）檢測(cè)10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測(cè)定（定量）檢 測(cè)20份樣品布局圖。圖2 96孔酶標(biāo)板檢測(cè) 20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1為例，在U型血凝板上按 50 /孔量用PBST將待檢血清從1:4開始 做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時(shí)，按圖示稀釋陰陽(yáng)性對(duì)照血清，然后每孔加入 50科1用 PBST稀釋到使用濃度

42、的亞I洲型口蹄疫病毒抗原（1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原對(duì)照孔加100 口。振蕩混勻，封板,4 C過夜。加入病毒抗原后血清的稀 釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3 .用洗滌液（1 X PBST）洗ELISA板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從 抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對(duì)應(yīng)孔，每孔50 口封板,37 C溫育1小時(shí)。4 .同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度（1:1000）, 每孔加50 口，封板,37 C溫育1小時(shí)。5 .同上洗板5次,甩干。用1XPBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 （1:500）,

43、 每孔加50 口封板,37 C溫育1小時(shí)。6 .同上洗板5次，每孔加50 口底物溶液（務(wù)必加雙氧水）,37 C溫育15分鐘。每孔再 加50 終止液終止反應(yīng)，立即在492nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值（OD492nm值）。五結(jié)果判定1 .試驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)每塊板設(shè)4孔病毒抗原對(duì)照，病毒抗原對(duì)照不加任何血清，直接用PBS而釋至使用 濃度，與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入 ELISA板孔,50科1/孔病毒抗原對(duì)照 OD492nm值 應(yīng)在1.5 0.5范圍內(nèi)。陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在 1:10241滴度以內(nèi)，陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)V 1:8。2 .病毒抗原對(duì)照平均 OD492nm值50%十算（臨界值）抗原對(duì)照是4孔，棄去

44、最高和最低 OD492nm1,計(jì)算剩余2孔的平均OD492nn，再除以 2,即50%寸照值。該值即為臨界值，表示阻斷50版應(yīng)的對(duì)照OD492nmt。3 .結(jié)果判定以病毒抗原對(duì)照平均 OD492nm值白50私臨界值，被檢血清稀釋孔 OD492nm直大于臨 界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔的OD492nm直等于臨界值時(shí) 所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對(duì)照平均OD492nm直為1.2,則其50%; 0.60。若某一待檢血清在 1:128時(shí)OD492nm直為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個(gè)滴度之間，如處于1 : 64與1: 12

45、8之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測(cè)中，兩個(gè)重復(fù)孔只要有一孔為陽(yáng)性孔，則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽(yáng)性孔，則判定 為抗體滴度1:128 。ELISA抗體效價(jià)1:128,判定為亞洲 1型口蹄疫抗體陽(yáng)性。ELISA抗體效價(jià)與保護(hù)力的關(guān)系：牛、羊：抗體效價(jià) 1:128,99% 保護(hù)；效價(jià)w 1:16, 不保護(hù)；效價(jià)在 1:22-90之間,50%保護(hù)。PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1、試劑的準(zhǔn)備所有的試劑在使用前，必須回溫到室溫。洗液（10x）: 1份清洗液加入到9份滅菌水或去離子水中，7天內(nèi)用完。清洗液使用前搖勻溶解。樣本稀釋液（3x）:1體積的樣稀釋液中加入 2體積的蒸儲(chǔ)水或去

46、離子水， 2天內(nèi)用完。2、樣本的準(zhǔn)備陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照不必稀釋，樣本用樣本稀釋液200倍稀釋，稀釋方法：取 5 口的樣本加入95 口的樣本稀釋液，再取稀釋了20倍的液體5 口加入到ELISA反應(yīng)孔中，再加入45 dl的樣本稀釋液。3、操作步驟將樣本和對(duì)照加入到板孔中。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照必須是雙份。1 .加入50 口陽(yáng)性和陰性對(duì)照，及 200倍稀釋的樣品在反應(yīng)板孔。2 .蓋上膜，在37c作用60分鐘。3 .去膜，用300口的洗液洗3遍，并在吸水紙上將平板弄干（顛倒，在紙上輕敲）4 .在每個(gè)空中加入50 口的酶標(biāo)抗體。5 .蓋上膜在37c作用60分鐘。6 .去膜，用300dl的洗液洗3遍，弄干。7

47、 .加入50 口的底物，輕搖板2次。8 .將平板放在黑暗中在 20-25C作用10分鐘。9 .加入50 口終止液，輕敲平板混勻。10 .用柔軟的東西輕拭平板上的贓物，在450nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果。讀數(shù)A.實(shí)驗(yàn)成立條件陽(yáng)性對(duì)照的平均值 OD4500.6,而且陽(yáng)性對(duì)照平均值/陰性對(duì)照平均值4.0.B.結(jié)果的稀釋結(jié)果用IRPC表示，以下是計(jì)算公式（OD 450樣品-OD450陰性對(duì)照平均值）IRPC = X100ODNEGIRPCPRR凱體說明小于或者等于20.0陰性大于20.0陽(yáng)性犬細(xì)小病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書原理：本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測(cè)犬血清中犬細(xì)小病毒IgG抗體。在聚苯乙烯微

48、孔酶標(biāo)板上，包被純化的犬細(xì)小病毒抗原。待檢血清中的CPM體與包被抗原特異結(jié)合，再與HR刖記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合，形成抗原抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物,加TM歌物作用顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD直判定結(jié)果。試劑盒的組成（96頭份）：1. CPM原反應(yīng)板12*8孔2. 20倍濃縮洗液30m1*1瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CPVW生對(duì)照300 d L*1 支5、CPVW生對(duì)照300 d L*1 支6、50倍CPV!結(jié)合物液300科L*l支7、酶結(jié)合物稀釋液15m1*1瓶8、底物液 A8m1*1瓶9.底物液B8m1*1瓶10、終止液8m1*1瓶11、封板膜2張12、自封袋1個(gè)13、說明書1張?jiān)噭?zhǔn)備：1

49、.將20倍濃縮洗液用蒸儲(chǔ)水稀釋 20倍后備用（30ml濃縮洗液+570m1蒸儲(chǔ)水）。2 .將50倍CPV1結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋50倍后備用（300u1 50倍CPV1結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液），輕振混勻，當(dāng)日用完。操作步驟：1 .待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作1:16倍預(yù)稀釋（150uL洗滌液+10uL待檢血清）備用。陰、陽(yáng)性對(duì)照不稀釋。2 .記下稀釋樣品的對(duì)應(yīng)編號(hào)，每次試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、各 2孔。3 .試劑盒平衡至室溫，在反應(yīng)板各孔中加入 100uL樣品稀釋液。再分別在相應(yīng)孔中加 入經(jīng)預(yù)稀釋的待檢血清 1OuL,然后在對(duì)照孔中分別加入10uL陰、陽(yáng)性對(duì)照。充分混勻

50、后，貼上封板膜，置37c溫育20分鐘。4 .小心揭掉封板膜，棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液，靜置約30秒，如此重復(fù)洗滌5次，最后一遍拍干。5 .每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100uL,貼上封板膜，置37c溫育20分鐘。6 .操作同步驟5。7 .每孔加入底物液 A50uL,再加入底物液B 50uL,輕拍?！勻，置37c避光顯色10分鐘。8 .每孔加入終止液50uL,輕輕振蕩，置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定 OD直。要求：1 .陽(yáng)性對(duì)照OD值有效范圍：0.60o2 .陰性對(duì)照OD值有效范圍：w 0.10（陰性對(duì)照若有一孔大于0.10應(yīng)舍棄，如果兩孔OD值都大于0.10,應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)）。結(jié)果判定：

51、1 .臨界值（Cut Off值）的計(jì)算：Cut Off值=（陽(yáng)性對(duì)照OW均值一陰性對(duì)照 OD平均值）X0.1+陰性對(duì)照 OW均值2 .待檢樣本OD值臨界值（Cut Off值）即判為CPM體具有彳護(hù)效價(jià)：小于臨界值（Cut Off值）即判為CPM體未達(dá)到保護(hù)效價(jià)。注意事項(xiàng)：1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)置室溫平衡后再打開密封袋，未用完的微孔反應(yīng)板條用自封袋加干燥劑保存。2 .各步加液均應(yīng)使用加液器并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3 .洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液，防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。4 .封板膜只限一次使用，以避免交叉污染。5 .結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，且終止反應(yīng)后應(yīng)在10

52、分鐘以內(nèi)測(cè)定其 OD直。6 .所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。7 .不同批次試劑不能混用。8 .請(qǐng)嚴(yán)格按說明書操作。犬瘟熱病毒抗體酶免測(cè)定試劑盒說明書原理本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測(cè)犬血清中犬瘟熱病毒IgG抗體。在聚苯乙烯微孔酶標(biāo)板上，包被純化的犬瘟熱病毒抗原。待檢血清中的CDVt體與包被抗原特異結(jié)合，再與HR刖記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加TM聰物作用顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定 OD直判定結(jié)果。試劑盒的組成（96頭份）：1、CDM原反應(yīng)板2、20倍濃縮洗液12*8 孔30ml*1 瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CDVM性對(duì)照300 d L*1 支5、CDV印日性對(duì)照300 d L*1支6、50倍CDV1結(jié)合物液300科L*l支7、酶結(jié)合物稀釋液15m1*1瓶8、底物液 A8m1*1瓶9.底物液B8m1*1瓶10、終止液8m1*1瓶