人體氨呼氣試驗(yàn)用于診斷幽門螺桿菌(Hp)感染

1、人體氨呼氣試驗(yàn)用于診斷幽門螺桿菌（Hp）感染的可行性研究理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系(精細(xì)化工) 方晴波學(xué)號(hào)：2001141024【摘要】本文研究通過(guò)測(cè)尿素分解所產(chǎn)生的氨氣來(lái)診斷幽門螺桿菌（Hp）感染的可行性。首先分析了影響人體呼氣氨的各種因素；然后在靛酚藍(lán)比色法的基礎(chǔ)上，針對(duì)氨氣極易溶于水、極易吸附于各種表面的特點(diǎn)以及人體呼氣成份的濃度易受空氣影響情況，對(duì)呼氣采集方法、測(cè)試試劑保存時(shí)間、采氣終點(diǎn)的判斷方法、以及最佳呼氣標(biāo)本采集時(shí)間等進(jìn)行了研究，確定氨呼氣試驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)方案。并照此實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了79例臨床試驗(yàn)研究，其中29例采用了服用堿劑以增加氨氣的排出的措施。以14C-尿素呼氣試驗(yàn)（14C-UBT）結(jié)果

2、作為Hp感染與否的金標(biāo)準(zhǔn)，將服用300mg尿素后受檢者呼氣氨的測(cè)試結(jié)果與14C-UBT結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)觀察氨呼氣試驗(yàn)用于Hp感染診斷的有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以目前所用的氨呼氣試驗(yàn)方案尚不能有效區(qū)分Hp感染的陰、陽(yáng)性病人。本文在最后部分還對(duì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能原因及繼續(xù)探索的方向進(jìn)行了討論?！娟P(guān)鍵詞】氨氣；幽門螺桿菌；14C-尿素呼氣試驗(yàn)；氨呼氣試驗(yàn)1.前言1.1背景幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是人類最古老且密切的伙伴之一，然而科學(xué)家費(fèi)了一個(gè)多世紀(jì)才認(rèn)清它們。它是一種革蘭氏陰性、螺旋狀微生物。該微生物主要存在于胃粘膜的粘液層，有時(shí)向前穿過(guò)粘液層到達(dá)其下的上皮細(xì)胞1。早在1875年，

3、德國(guó)解剖學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了寄居在人體胃粘膜層的螺旋樣細(xì)菌，但是由于無(wú)法培養(yǎng)出純系菌株，這項(xiàng)結(jié)果于是遭到忽視而遺忘。直到1982年，澳大利亞醫(yī)生Barry J.Marshall和J.Robin Warren才分離出這種細(xì)菌，使幽門螺桿菌在胃內(nèi)作用的研究得以開展。接下來(lái)的10年里，研究者發(fā)現(xiàn)胃里帶有這種微生物的人，罹患消化性潰瘍（胃壁或十二指腸壁破損）的風(fēng)險(xiǎn)較高，并且幽門螺桿菌還可能引起一種最常見的胃癌2。1987年Gramhan等3提出13C-尿素呼吸試驗(yàn)（13C-urea breath test, 13C-UBT），緊接著Bell等4提出的14C尿素呼氣試驗(yàn)（14C-urea breath test

4、, 14C-UBT）,自1998年和2000年美國(guó)FDA和中國(guó)SFDA相繼批準(zhǔn)14C-UBT用于臨床后，該方法已成為全球臨床診斷胃幽門螺桿菌感染普遍采用的試驗(yàn)。兩者都是根據(jù)試驗(yàn)胃幽門螺桿菌分泌大量活力很高的尿素酶而設(shè)計(jì)的。尿素酶可以將尿素催化水解成氨離子和碳酸氫離子?？诜?3C-尿素或14C-尿素后，則會(huì)生成的標(biāo)記H13/14CO3-(13/14C尿素H2ONH4+ H13/14CO3-)，后者吸收入血，最后由肺泡以13/14CO2形式呼出。測(cè)試呼氣中的13/14CO2，便可診斷感染存在與否。實(shí)踐證明，二者診斷都十分準(zhǔn)確。區(qū)別在于14C屬長(zhǎng)壽命放射性核素，雖操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，微劑量使用對(duì)人體無(wú)

5、害，但不乏懷疑者；13C則屬穩(wěn)定核素，但操作較復(fù)雜、費(fèi)用昂貴,臨床取舍，爭(zhēng)論不休。所以我們嘗試尋求一種既便宜又對(duì)人體、環(huán)境沒(méi)輻射的一種非侵入性診斷方法。1.2 目的由于尿素酶將尿素分解為NH3和CO2，2001年，英國(guó)學(xué)者Dune等5就想到了尿素水解產(chǎn)物的另一半氨。事實(shí)上已有文獻(xiàn)報(bào)道，幽門螺桿菌感染者胃液尿素濃度很低，而氨濃度明顯高于正常人。在體外人工模擬胃的研究基礎(chǔ)上，Dune等使用自制的聚吡咯氨傳感（polypyrrole ammonia sensor），嘗試通過(guò)測(cè)試堿化胃液后口腔氣體NH3（oral ammonia vapor）診斷胃幽門螺桿菌感染。比較口服Mg(OH)2前后口氣NH3濃

6、度變化，診斷幽門螺桿菌感染是可行的。另外，2002年，美國(guó)學(xué)者Kearney等6報(bào)道了非標(biāo)記尿素/NH3呼氣試驗(yàn)（unlabeled urea/ammonia breath test）。所用儀器是自行研制的光纖氨傳感器（fiberoptic ammonia sensor）。受試者口含儀器的接口器呼吸，即可立即檢出NH3濃度。結(jié)果顯示，陽(yáng)性者基礎(chǔ)呼氣NH3水平低于陰性者，分別為0.04±0.09ppm和0.49±0.24ppm，服用非標(biāo)記尿素和酸中和劑后，陽(yáng)性者呼氣NH3水平增幅顯著高于陰性者，分別為1981494和698。結(jié)果同樣提示，非標(biāo)志尿素/氨呼氣試驗(yàn)在診斷幽門螺桿菌

7、感染是可行的。奇怪的是，不知什么原因，隨后沒(méi)再發(fā)現(xiàn)有后續(xù)文章，也沒(méi)有進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用。本文目的就是要探索通過(guò)測(cè)NH3而不是測(cè)CO2來(lái)診斷Hp感染是否確實(shí)可行。2.影響人體呼氣氨的因素分析2.1 體內(nèi)氨（ammonia，NH3）的來(lái)源2.1.1 體內(nèi)細(xì)菌代謝在尿素酶陽(yáng)性菌作用下，肝臟所產(chǎn)尿素分解是血氨（ammonia，NH3）最主要來(lái)源，也是其它體液氨的主要來(lái)源。胃腸道每天產(chǎn)氨約4g。正常情況下，結(jié)腸是尿素分解產(chǎn)氨最重要場(chǎng)所，此處細(xì)菌量最大；幽門螺桿菌被發(fā)現(xiàn)后，胃內(nèi)產(chǎn)氨受到重視；口咽部若存在尿素酶陽(yáng)性細(xì)菌，也可產(chǎn)氨；生殖道受變形桿菌等尿素酶感染時(shí)，產(chǎn)氨會(huì)顯著增多；其它部位細(xì)菌產(chǎn)氨有限。未消化吸收

8、的蛋白質(zhì)，氨基酸在結(jié)腸道腐敗菌的作用下也是氨的重要來(lái)源。未消化吸收蛋白質(zhì)越多，產(chǎn)氨的量越大。2.1.2 機(jī)體細(xì)胞代謝氨基酸的脫氨生化反應(yīng)是機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)氨的主要方式。脫氨反應(yīng)有多種，包括氨基酸氧化脫氨、聯(lián)合脫氨、嘌呤核苷酸循環(huán)脫氨等。2.2 體內(nèi)氨的去路氨的去路有合成尿素、谷氨酰胺、氨基酸和其它含氨化合物和直接排泄體外兩大方式。消化道所產(chǎn)的氨，除了一部分吸收入血外，另一部分則直接隨糞便排出體外；腎臟除了分泌氨以外，通血液濾過(guò)也可直接排氨；血氨通過(guò)彌散入肺泡，可從呼氣排出，其量有限；口咽部、呼吸道和生殖道所產(chǎn)的氨，除了吸收，也一樣可以直接排出；皮膚排氨也有一定作用。2.3 pH對(duì)氨吸收和排泄的影響氨

9、極易溶于水，與水的氫離子結(jié)合生成氨離子（ammonium ion，NH4）。后者亦稱為銨。溶液中NH3與NH4的相對(duì)量決定于溶液的pH。在酸性環(huán)境中，氫離子可將全部NH3轉(zhuǎn)化成NH4；將溶液堿化，NH4失去氫離子而又轉(zhuǎn)化成NH3；溶液pH9.3時(shí)，NH3與NH4的相對(duì)量各半。溶液pH對(duì)NH3與NH4的相互轉(zhuǎn)化決定性的影響不僅是氨測(cè)定技術(shù)的重要理論基礎(chǔ)，而且更為重要的是影響機(jī)體對(duì)氨的吸收和排泄。NH3是可以自由透過(guò)細(xì)胞膜的揮發(fā)性氣體，而NH4則不能。酸化胃腸道和尿液，顯然有利于NH4的生成和排泄，從而降低血氨；相反，堿性環(huán)境則增加NH3從腸道吸收和減少NH4從腎臟排泄，導(dǎo)致血氨升高。雖然，堿性體

10、液時(shí)，呼氣氨濃度會(huì)上升，但不利于總體排氨。2.4 影響呼氣氨的因素呼氣中的氨不僅僅是由血液彌散入肺泡的氨氣，還包括以下來(lái)源：第一個(gè)便是來(lái)自吸入空氣中的氨。無(wú)污染近地面大氣氨濃度小于20ppb【7】，但氨污染十分常見。了解這一點(diǎn)很重要，呼氣氨測(cè)試必須注意測(cè)試環(huán)境氨的影響。口咽部細(xì)菌代謝的產(chǎn)氨作用也不可忽略。胃內(nèi)氨氣進(jìn)入口咽部更值得注意。即便是從肺部而來(lái)的氨也包括氣道生成氨和由血彌散入肺泡的氨氣。由于口鼻相通，口氣和呼氣成分是互為影響的?？跉鈶?yīng)受口腔、胃氣的影響大些，而呼氣則受肺泡、氣道影響大些。深呼吸取得的氣體標(biāo)本，主要來(lái)自肺泡。3.實(shí)驗(yàn)部分3.1實(shí)驗(yàn)試劑與配制無(wú)氨蒸餾水：見附錄A吸收液C(H2

11、SO4)=0.005mol/L:量取2.8ml濃硫酸加入水中，并稀釋至1L。臨用時(shí)再稀釋10倍。C（NaOH）2mol/L:稱取16g氫氧化鈉溶于200ml水中。水楊酸溶液（50g/L）：稱取10.0g水楊酸C6H4(OH)COOH和10.0g檸檬酸鈉（Na3C6O7·2H2O），加水約50ml，再加55ml氫氧化鈉溶液C（NaOH）=2mol/L，用水稀釋至200ml。此試劑稍有黃色，室溫下可穩(wěn)定一個(gè)月。亞硝基鐵氰化鈉溶液（10g/L）：稱取1.0g亞硝基鐵氰化鈉Na2Fe（CN5·NO·2H2O，溶于100ml水中，貯于冰箱中可穩(wěn)定一個(gè)月。次氯酸鈉溶液（NaC

12、lO）=0.05mol/L）：取1ml次氯酸鈉試劑原液，然后用氫氧化鈉溶液C（NaOH）=2mol/L稱釋成0.05mol/L的溶液。貯于冰箱中可保存兩個(gè)月。次氯酸鈉原液濃度的標(biāo)定見附錄B。氨標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取0.3153g經(jīng)105干燥1h的氯化銨（NH4Cl），用少量水溶解，移入100ml容量瓶中，用吸收液稀釋至刻度，此液1.00ml含1.00mg氨。標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用時(shí)，取1ml標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用吸收液稀釋到1000ml容量瓶中使1.00ml含1.00m氨。3.2實(shí)驗(yàn)儀器紫外分光光度計(jì)：可測(cè)波長(zhǎng)為698nm，狹縫小于20nm。氣體采樣器：功率為4W，氣體流量為3.5L/min的抽氣泵。大

13、型氣泡吸收管：有10ml刻度線，出氣口內(nèi)徑為1mm，與管底距離應(yīng)為35mm。具塞比色管（10ml）：30支。醫(yī)用體外引流袋：1000ml/個(gè)。玻璃容器：蒸餾裝置、酸式滴定管、容量瓶、碘量瓶、燒杯等。3.3呼氣氨測(cè)試方法研究氨氣（NH3）是一種無(wú)色、具有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體，具有強(qiáng)的吸附性，極易溶于水，并且在很多地方都可存在，又由于人體中氨氣的含量很低，所以要準(zhǔn)確測(cè)量微量氨氣具有很高的難度，要去除干擾氨氣測(cè)量的因素和準(zhǔn)確測(cè)量呼氣氨顯得十分重要。精確測(cè)量微量氨氣的方法和儀器仍是研究者探索的目標(biāo)8。目前氨氣的化學(xué)測(cè)定方法相對(duì)較成熟的主要有納氏試劑比色法、靛酚藍(lán)比色法等，其中納氏試劑比色法因操作簡(jiǎn)便，

14、顯色快速，一般多被采用；靛酚藍(lán)比色法靈敏度高，顯色較穩(wěn)定，干擾少，但操作條件要求嚴(yán)格，顯色時(shí)間長(zhǎng)是影響快速測(cè)定的主要原因9。本實(shí)驗(yàn)主要以GB/T18204.25公共場(chǎng)所空氣中氨測(cè)定方法中靛酚藍(lán)比色法為基礎(chǔ)10，根據(jù)呼氣富含水蒸汽和易受空氣影響的特點(diǎn)，進(jìn)行了一些氣體采樣方法的摸索和改進(jìn)。具體為：（一）怎樣采集人體呼氣中的微量氨氣。（二）怎樣準(zhǔn)確測(cè)量氨氣的含量。（三）探索尋求測(cè)量結(jié)果平行性的條件。3.3.1靛酚藍(lán)比色法測(cè)定微量氨氣3.3.1.1微量氨氣測(cè)定的原理氨被稀硫酸吸收液吸收后，生成硫酸銨。在亞硝基鐵氰化鈉存在下，銨離子、水楊酸和次氯酸鈉反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，根據(jù)顏色深淺，用分光光度計(jì)在最大波

15、長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。靈敏度:10mL吸收液中含有1.0g氨應(yīng)有0.081吸光度。線性范圍:10mL樣品溶液中含有010.0g氨。精密度：10mL吸收液中氨含量為1.010.0g，重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%。3.3.1.2微量氨氣測(cè)定的方法與步驟3.3.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（一）取10ml具塞比色管7支，制備標(biāo)準(zhǔn)系列管。如表1：表1：氨標(biāo)準(zhǔn)系列管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)工作液ml吸收液ml氨含量g0010.00010.259.750.2521.009.001.0033.007.003.0045.005.005.0057.003.007.00610.00010.00（二）氨標(biāo)準(zhǔn)系列在各管中加入0.50ml水楊酸

16、溶液，再加入0.10ml亞硝基鐵氰化鈉溶液和0.10ml次氯酸鈉溶液，混勻，室溫下放置1h。1cm比色皿，以水作參比，以4號(hào)比色管測(cè)600nm700nm的吸光度，測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)。測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)max 689nm于波長(zhǎng)689nm處，以水作參比，測(cè)定各管溶液的吸光度。管號(hào)0123456吸光度A0.0430.1480.1820.3500.5160.6400.928以氨含量（g）作橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算校準(zhǔn)曲線的斜率、截距及回歸方程，如圖1：圖1：氨氣的標(biāo)準(zhǔn)曲線注：Y=bX+a式中：Y標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度；X氨含量，g；a回歸方程式的截距；b回歸方程式斜率，吸光度/g。所以標(biāo)準(zhǔn)方程

17、為y0.0827xa（a為空白值）標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率b為0.0827吸光度/g氨。由上圖可知，斜率0.0827在理想范圍內(nèi)（0.081±0.003），最大吸收波長(zhǎng)689nm與文獻(xiàn)中的687nm相似。 3.3.1.2.2采樣用一個(gè)內(nèi)裝10ml吸收液的大型氣泡吸收管，以0.5L/min流量，采氣4000ml或者2000ml。采樣后，樣品在室溫下保存，于24h內(nèi)分析。3.3.1.2.3樣品測(cè)定將樣品溶液轉(zhuǎn)入具塞比色管中，用少量的水洗吸收管，合并，使總體積為10ml。再按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟測(cè)定樣品的吸光度。在每批樣品測(cè)定的同時(shí)，用10ml未采樣的吸收液作試劑空白測(cè)定。注：ppm計(jì)算公式：m&#

18、215;22.4×103/17×103×V(m為氨氣的質(zhì)量，單位為g；V為采樣體積，單位為L(zhǎng))3.3.2氣體采樣器抽氣和人吹氣兩種方法的比較尋求測(cè)量結(jié)果平行性的條件，本文比較兩個(gè)方法人吹氣法和氣體采樣器抽氣法對(duì)結(jié)果平行性的影響。對(duì)兩個(gè)受檢者分別采樣2000ml，測(cè)其吸光度，求其含量，采用平行性相對(duì)好的實(shí)驗(yàn)方法。3.3.2.1人吹氣試驗(yàn)用一個(gè)內(nèi)裝10ml吸收液的大型氣泡吸收管，以0.40.6L/min流量，收集2000ml呼氣（以1000ml的醫(yī)用體外引流袋為標(biāo)準(zhǔn)），連續(xù)采三個(gè)樣本。采樣后，將樣品溶液轉(zhuǎn)入具塞比色管中，在各管中加入0.50ml水楊酸溶液，再加入0.1

19、0ml亞硝基鐵氰化鈉溶液和0.10ml次氯酸鈉溶液，混勻，室溫下放置1h后于波長(zhǎng)689nm處，以水作參比，測(cè)定各管溶液的吸光度。3.3.2.2利用抽氣泵抽氣試驗(yàn)利用抽氣泵抽氣原理，對(duì)其進(jìn)行改裝，如圖2所示，只要讓吹氣者自然呼吸即可。采樣完后，步驟如上。圖2：氣體采樣器模型3.3.2.3結(jié)果與討論注：根據(jù)變異系數(shù)C.V.的大小判斷平行性的好壞標(biāo)準(zhǔn)差X表示個(gè)體，為樣本平均數(shù)，n為樣本數(shù)量。標(biāo)準(zhǔn)差除以平均數(shù)所得的比值，稱為變異系數(shù)11：表2：人吹氣2000ml中氨氣的含量及變異系數(shù)2004-10-26(4000ml/次) 空白值：0.131（吸光度）受檢者12次數(shù)12平均值12平均值吸光度A0.35

20、00.7010.5260.3400.5690.455氨的含量g2.6486.8924.7702.5305.3003.920ppm0.8722.271.5710.8311.7501.290吸光度的變異系數(shù)47.2%35.6%表3：人吹氣2000ml中氨氣的含量及變異系數(shù)表4：氣體采樣器收集2000ml氣體中氨氣的含量及變異系數(shù)20041029（2000ml/次） 空白值：0.077（吸光度）受檢者12次數(shù)123平均值123平均值吸光度A0.3880.4550.3730.4050.1910.2680.3810.280氨的含量g3.7604.5703.5803.9701.3802.3103.6802

21、.460ppm2.4803.0102.3902.6200.9101.5102.4201.620吸光度的變異系數(shù)10.8%34.1%20050112（2000ml/次） 空白值：0.043條件空氣/吸光度A受檢者1/吸光度A受檢者2/吸光度A12變異系數(shù)123變異系數(shù)123變異系數(shù)10.0900.1068.2%0.1520.1160.13413.4%0.2720.2890.33010%20.0680.0550.06310.6%0.2120.2150.2140.73%30.0950.0870.0894.6%0.3840.4310.41011.1%注：條件1：先通氣（空氣或呼氣）5分鐘，隨后用氣體采

22、樣器收集氣體。條件2：先通氣（空氣或呼氣）5分鐘，隨后人體呼氣。條件3：不通氣，隨后用氣體采樣器收集氣體。將變異系數(shù)結(jié)果的數(shù)據(jù)以散點(diǎn)的形式，繪制在同一散點(diǎn)圖上，分為兩大區(qū)域，橫坐標(biāo)（14）單位為吹氣變異系數(shù)的分布區(qū)域，橫坐標(biāo)（1016）單位為抽氣變異系數(shù)的分布區(qū)域，如圖3所示：圖3：吹氣和抽氣變異系數(shù)的散點(diǎn)圖由以上結(jié)果和圖3可知，人吹氣的變異系數(shù)在10.847.2范圍內(nèi)，而氣體采樣器抽氣的變異系數(shù)為0.7313.4內(nèi)，散點(diǎn)分布比吹氣密集，所以用氣體采樣器抽氣的平行性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于人體直接吹氣。另外，考慮到呼氣氨可能吸附在經(jīng)過(guò)的管子上，所以采取了表4的條件1和條件3的方法，由結(jié)果可知，預(yù)先通氣和不通氣

23、并不存在較大的差異，因此預(yù)先不通氣不影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。3.3.3試劑（吸收液、顯色劑）的放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響由于本實(shí)驗(yàn)所用的試劑都嚴(yán)格要求為無(wú)氨試劑，而氨氣又存在于空氣中，為了考查放置于空氣中數(shù)天后（一個(gè)月以內(nèi)）的試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)是否有影響，因此分別配制兩個(gè)批次的試劑吸收液（同一顯色劑，放置幾天后的吸收液）、顯色劑（同一吸收液，放置幾天后的顯色劑），結(jié)果如表5、表6所示：表5：放置22天后的吸收液對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響批次空白/吸光度A通空氣后/吸光度A扣除空白后/吸光度A10.0300.2760.2462（放置22天）0.0310.2990.268注：批次1：12月22號(hào)配制的吸收液，1月14號(hào)配的顯色劑。

24、批次2：12月22號(hào)配制的吸收液放置了22天后（1月14號(hào)），1月14號(hào)配的顯色劑。表6：放置3天后顯色劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響批次空白/吸光度A通空氣后/吸光度A扣除空白后/吸光度A10.0420.1260.0842（放置3天）0.0630.1580.095注：批次1：1月14號(hào)配置的顯色劑，1月17號(hào)配制的吸收液。批次2：1月14號(hào)配制的顯色劑放置三天后（1月17號(hào)），1月17號(hào)配制的吸收液。以上表5的數(shù)據(jù)顯示吸收液放置22天后（室溫密封存放），吸光度有微小的提高，可能由于吸附了空氣中的雜質(zhì)或氨氣所引起的，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響不大。表6的數(shù)據(jù)顯示了顯色劑放置3天后（存放于冰箱），吸光度也有微小的提高，原因如上

25、，但對(duì)實(shí)驗(yàn)影響也不大。所以表明實(shí)驗(yàn)試劑室溫密封或冰箱存放一個(gè)月內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響不大。3.3.4二氧化碳?xì)w一化和固定體積法判斷采氣終點(diǎn)的比較3.3.4.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋C(jī)器抽氣時(shí)人如果不是出于自然呼吸狀態(tài)，氣體中有可能帶進(jìn)了很多的空氣，而不是通過(guò)肺部呼出來(lái)的氣體。為了校正這一偏差，采用二氧化碳?xì)w一化法。由于海胺吸收二氧化碳的能力很好，可以達(dá)到99以上，加入酚酞指示劑后，溶液變成紅色，呼氣中的二氧化碳被海胺吸收飽和后，紅色消失，以此代替氣袋判斷抽氣的停止時(shí)間。3.3.4.2實(shí)驗(yàn)方法移取10ml已配置好的0.5mol/L的海胺溶液于大型氣泡管B中，加入幾滴酚酞指示劑，溶液呈紅色，按照前面所述的抽氣實(shí)驗(yàn)，把大

26、型氣泡管B放置大型氣泡管A后，直到紅色消失為止。3.3.4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論表7：二氧化碳?xì)w一化法和固定體積法平行性的比較性質(zhì)受檢者1/吸光度A變異系數(shù)受檢者2/吸光度A變異系數(shù)機(jī)器抽氣/吸光度(6000ml/次沒(méi)有海胺吸收)0.3400.2500.30015.20.4600.4230.4414.2機(jī)器抽氣/吸光度（利用海胺變色作為依據(jù)，50006000ml/次）0.1060.0960.15225.30.1770.2340.42346.3以上結(jié)果顯示，用二氧化碳（海胺變色）歸一法的平行性（變異系數(shù)為25.3，46.3）沒(méi)有用采固定體積法的平行性（變異系數(shù)為15.2，4.2）好。所以試驗(yàn)后期都是

27、統(tǒng)一采3000ml氣體為標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)橛蓹z查下線為0.5µg/10ml計(jì)算出來(lái)2000ml氣體時(shí)的檢查出氨氣的ppb值為328，3000ml時(shí)為238，并且有關(guān)文獻(xiàn)指出，陽(yáng)性患者的氨氣本底為200ppb左右,所以選擇采3000ml氣體。3.3.5氨呼氣試驗(yàn)（觀察服用尿素后氨氣含量的變化）據(jù)國(guó)外一篇文獻(xiàn)記載，利用人體呼氣中在本底與口服尿素膠囊后1530分鐘的氨氣含量變化來(lái)分辨Hp陽(yáng)性和陰性患者6。本文通過(guò)類似的方法找出氨氣含量變化的時(shí)間段。每隔5分鐘采一次氣體樣本，一共14個(gè)，測(cè)其吸光度，計(jì)算氨氣的含量，找出變化躍點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)間段，可作為于臨床試驗(yàn)中服用尿素后的相隔時(shí)間。數(shù)據(jù)如下：表8：受檢

28、者1呼氣氨的吸光度隨時(shí)間的變化05.01.23（3000ml/次） 空白值：0.054時(shí)間/min性質(zhì)吸光度A0空氣0.0468呼氣本底0.04617服用300mg尿素220.027300.045370.053450.059520.072590.076620.064690.074750.125820.081890.107990.222由以上數(shù)據(jù)可知，在服用300mg尿素3542分鐘后吸光度達(dá)到第一個(gè)最高值，第二個(gè)峰在61分鐘時(shí)吸光度達(dá)到0.125。如圖4所示：圖4：吸光度與時(shí)間關(guān)系的曲線圖表9：受檢者2呼氣氨的吸光度隨時(shí)間的變化05.01.24（2000ml/次） 空白值：0.046時(shí)間/mi

29、n性質(zhì)吸光度A0空氣0.0386呼氣本底0.1311服用300mg尿素120.126170.159230.175280.097330.216380.252430.177480.139530.165590.263640.216690.174750.333由以上數(shù)據(jù)可知，在服用300mg尿素2227分鐘吸光度達(dá)到第一個(gè)峰值，4248分鐘吸光度達(dá)到第二個(gè)峰。如圖5所示：圖5：吸光度與時(shí)間的關(guān)系曲線圖3.3.6氨呼氣試驗(yàn)方法的最佳實(shí)驗(yàn)方案（一） 氣體采樣器抽氣的平行性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于人體直接吹氣，采取氣體采樣器法。（二） 預(yù)先通氣和不通氣并不存在較大的差異，由于實(shí)驗(yàn)中時(shí)間的限制，可采取不預(yù)先通氣。（三） 由于

30、實(shí)驗(yàn)試劑室溫密封或冰箱存放一個(gè)月內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響不大，臨床實(shí)驗(yàn)中所用試劑存放不能超過(guò)一個(gè)月。（四） 二氧化碳（海胺變色）歸一法的平行性沒(méi)有用采統(tǒng)一體積氣體的平行性好。所以臨床試驗(yàn)都統(tǒng)一采3000ml氣體為標(biāo)準(zhǔn)。（五）由服用尿素后吸光度與時(shí)間的關(guān)系曲線圖，可采用的臨床的采氣時(shí)間分別為服用尿素前，服用尿素后15分鐘，服用尿素后25分鐘。3.4臨床試驗(yàn)3.4.1 14CUBT試驗(yàn)3.4.1.1 14CUBT試驗(yàn)的原理Hp可產(chǎn)生豐富的尿素酶，若人胃中有Hp存在，則口服尿素快速被尿素酶分解，成為二氧化碳和氨氣：二氧化碳和氨氣溶于胃液中形成碳酸氫鹽和銨，碳酸氫鹽被吸收進(jìn)入血液，經(jīng)肺部以14CO2形式呼出，并

31、被收集在液閃瓶中，再進(jìn)行液閃測(cè)定。若胃內(nèi)無(wú)Hp，則絕大部分尿素被吸收后從尿液中排出，而不從肺部排出。利用這種差別即可準(zhǔn)確地診斷人胃內(nèi)Hp感染【12】。3.4.1.2 14CUBT試驗(yàn)的方法與步驟：穿插在ABT試驗(yàn)中清晨空腹，溫水送服14C尿素膠囊（深圳市中核海得威生物科技有限公司提供）1粒，劑量:0.75ci/粒，開啟CO2集氣試1瓶（內(nèi)有閃爍液，含1ml氫氧化海胺甲醇液，1ml無(wú)水乙醇，1酚酞一滴），向液閃瓶?jī)?nèi)插入氣體導(dǎo)管，導(dǎo)管下端浸入集氣瓶中，受試者通過(guò)導(dǎo)管吹氣，力度適中，避免液體濺出，當(dāng)CO2試劑由紫紅色變無(wú)色時(shí)停止吹氣(約1一3min)，超過(guò)3min退色不全亦停止吹氣。加人稀釋閃爍液4

32、.5m1（含0.7PPO，0.05POPOP的二甲苯液），加蓋密封、溶解、搖勻后做14C放射性濃度2min測(cè)定，l00dpm/mmolCO2為陽(yáng)性【13】。3.4.2 ABT試驗(yàn)（ammonia breath test）3.4.2.1 ABT試驗(yàn)的原理?yè)?jù)上方程式可知，尿素被分解成氨氣和二氧化碳，然而目前世界上對(duì)氨氣在診斷Hp的有關(guān)研究很少，主要原因是氨氣在呼氣中的含量非常低（1002000ppb），強(qiáng)吸附性，使到測(cè)量困難，并且使用一般傳統(tǒng)的傳感器也是不可靠的【6】。但是，可以根據(jù)14C尿素呼吸試驗(yàn)的原理，利用尿素水解產(chǎn)物的另一半氨的差別來(lái)診斷人胃內(nèi)Hp感染【6】。3.4.2.2 ABT試驗(yàn)的方

33、法與步驟(一)受檢者服用尿素前（測(cè)其本底）用一個(gè)內(nèi)裝10ml吸收液的大型氣泡吸收管，以0.5L/min流量，對(duì)病人采氣3000ml，采樣后，將樣品溶液轉(zhuǎn)入具塞比色管中（加入0.5ml水楊酸溶液、再加入0.10ml亞硝基鐵氰化鈉溶液，和0.10ml次氯酸鈉溶液，混勻，在室溫下放置1h，用1cm比色皿，于波長(zhǎng)698nm處，以水作參比，測(cè)定此管溶液的吸光度，在每個(gè)樣品測(cè)定的同時(shí)，用10ml未采樣的吸收液作試劑空白測(cè)定）。(二)受檢者服用尿素后（服用300mg尿素為兩個(gè)膠囊和一個(gè)14C標(biāo)記尿素膠囊）清晨空腹，溫水送服14C尿素膠囊1粒和兩粒沒(méi)有標(biāo)志的尿素膠囊，服用后，過(guò)15min，采一次3000ml的

34、氣體（約三分鐘），隨后做14C尿素呼吸試驗(yàn)，接著采3000ml氣體，實(shí)驗(yàn)步驟如上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取前后兩次的平均值。3.4.3臨床對(duì)照3.4.3.1研究對(duì)象79例消化內(nèi)科門診檢查病人(其中50例為測(cè)肺泡氣中的氨氣，29例為測(cè)胃液里的氨氣，由于加入了堿劑350mg/mlCa(OH)2和350mg/mlMg(OH)225ml,試圖將胃液里的氨氣趕出來(lái))接受14CUBT（urea breath test）和ABT（ammonia breath test）方法。通過(guò)14C尿素呼吸試驗(yàn)檢測(cè)的Hp陽(yáng)性26例，陰性53例。其中男性41例，女性38例，年齡1764歲，平均33歲。其中慢性胃炎（CSG）41例，球部潰

35、瘍（Du）14例，其余還有多例復(fù)合性潰瘍、胃食管反流（RE）、口氣、腹?jié)q、消化不良、糜爛性胃炎。以14C尿素呼吸試驗(yàn)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。3.4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論表10：50例受檢者呼氣氨與14CUBT結(jié)果的比較編號(hào)性別年齡臨床癥狀14CUBT結(jié)果呼氣氨變化率1男47CSG23（）2332男2912指腸球部潰瘍64（）1603男35口氣17（）734男32腹?jié)q，口臭91（）95女22CSG22（）19006男64復(fù)合性潰瘍76（）41.77女52CSG203（）59.18女59胸骨不適34（）46.79男42球部潰瘍75（）8710男22CSG363（）3011女28CSG146（）91.312

36、男32Du543（）56.313女30CSG23（）163.514男31Du103（）470015男28CSG28（）233.316女37口氣20（）40017男31CSG676（）91.718女31CSG25（）188.919男52CSG18（）35020女47CSG1034（）72.721女28胸部痛25（）104.322男32胃食管反流22（）7023男24CSG178（）5024男32CG226（）90025女24消化不良205（）10926女38CSG30（）99.227女21糜爛性胃炎192（）10528男29腹?jié)q83（）2250029女33FD52(-)107.530女25CSG

37、25（）44.431男28CSG15（）26.732男28CSG18（）18.833女37Du94（）35.134男30體檢19（）3735女36口氣352（）4036男2912指腸潰瘍13（）71.437男33CSG78（）98.438男28胃食管反流19（）10039女35CSG,口氣285（）150040男22CSG35（）607.141女33CSG97（）72.742女29CSG414（）5043男17胃炎345（）262.544女22CSG116（）83.345男39Du86（）83.346男44Du23（）10047女39CG（平坦性糜爛）179（）2504.248女26CSG39

38、（）342.949男50CSG25（）90.650女30CSG203（）66.7另外29例在ABT試驗(yàn)過(guò)程中喝下25ml堿劑pH調(diào)節(jié)劑，由于氨基離子在離子狀態(tài)時(shí)不容易通過(guò)胃粘膜從而被吸收，所以需要提高胃液的pH值，從而把胃液里的氨氣趕出來(lái)。但是受檢者呼氣氨值沒(méi)有明顯提高，可能是服用的堿劑量太少，（在ABT試驗(yàn)中口服尿素膠囊后15分鐘，其它步驟不變）結(jié)果如表11：表11：29例受檢者呼氣氨與14CUBT結(jié)果的比較（喝下堿劑）編號(hào)性別年齡臨床癥狀14CUBT結(jié)果ppm變化率51女35呃遞123（）316.752男30Du21（）35053女30CSG34（）054女36CSG23（）22.755女

39、44CSG210（）21.156男28CSG459（）4057女37貧血，呼吸道出血21（）66.758女47CSG13（）38.559男40體檢41（）3260女36慢性胃炎22（）352.861男31球部潰瘍，Hp治療后21（）6.962女25CSG83（）41.763男32CSG9（）43.7564男21口氣14（）31.365男23Du58（）112.566男24CSG125（）18.267男28球部潰瘍28（）37.568女36CSG14（）68.869男42Du75（）18.7570女30Du102（）787.571男38Du25（）2572女26CSG75（）6573女24CSG

40、137（）66.774女24CSG16（）14.375男35體檢68（）13076男25CSG26（）222577女55CSG16（）30078男40球部潰瘍200（）30079女29慢性胃炎135（）9.5本實(shí)驗(yàn)的79例研究對(duì)象，在服用尿素后大部分都與本底有著顯著的差異（P<0.05），但是Hp+與Hp-病人并沒(méi)有被觀察到有如上文獻(xiàn)所說(shuō)的差異性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)14CUBT試驗(yàn)診斷出來(lái)的26例Hp感染者（陽(yáng)性）有6例“尿素”的ppm比“本底”ppm顯著降低(P<0.05)，7例“尿素”ppm比“本底”ppm顯著升高(P<0.05)，其余13例均沒(méi)有太大的變化(P>0.05)

41、。而53例顯示Hp陰性的病人有33例“尿素”的ppm與“本底”ppm相差不大(P>0.05)，20例“尿素”的ppm與“本底”ppm相差較大(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)對(duì)Hp感染的診斷沒(méi)有明顯的指示作用。原因可能如下：微量氨氣很難準(zhǔn)確測(cè)量，在采集過(guò)程中，干擾因素太多，如：氨氣也會(huì)吸附在沾有水珠的收集管上都有可能影響測(cè)量的結(jié)果。而且目前測(cè)量微量氨氣的高新技術(shù)儀器并不多，如專門測(cè)量人體呼出氨氣的Breath Ammonia Analyzer（Pranalytica研究生產(chǎn)8）如圖6： 圖6：Breath Ammoina Analyzer由于前面50例沒(méi)有用到pH調(diào)節(jié)劑，我們認(rèn)為可能由于肺

42、泡出來(lái)的氨氣含量非常低，所以數(shù)據(jù)沒(méi)有太大的差異。所以后來(lái)假想如果迅速提高胃液的pH值，從而達(dá)到將氨基離子轉(zhuǎn)化成氨氣分子，并且提高了它在血液中的吸收性，進(jìn)而提高呼氣中氨氣的含量，所以采用了在口服尿素膠囊15分鐘后口服25mlpH調(diào)節(jié)劑。但是由最后29例的數(shù)據(jù)來(lái)看，Hp+和Hp-的受檢者的呼氣氨值還是沒(méi)有明顯的規(guī)律性。原因可能如下：（一）可能本實(shí)驗(yàn)用的25ml堿液不夠明顯提高胃液里的pH值而使氨基離子轉(zhuǎn)化為氨氣。（二）另外，有關(guān)文獻(xiàn)中也有提到所用的堿劑不能有效的使釋放胃液中氨，本文的數(shù)據(jù)也表明加了堿劑后胃液里的氨氣還是沒(méi)有大部分地出來(lái)，需進(jìn)一步研究哪種配比的堿液可以起到把胃液里的氨氣趕出來(lái)的作用。

43、4.結(jié)論 用測(cè)定公共場(chǎng)所氨的方法靛酚藍(lán)比色法來(lái)測(cè)定人體呼氣中的微量氨氣，靈敏度高，顯色較穩(wěn)定，但是顯色時(shí)間較長(zhǎng)為一小時(shí)。 采用氣體采樣器氣泵抽氣時(shí)，平行性比人體呼吸吹氣法好。 采固定體積法來(lái)判斷采氣終點(diǎn)的平行性比二氧化碳（海胺變色）歸一法的平行性好。 不喝堿液的前50例，和喝堿液的29例均不能有效區(qū)分Hp感染的陰、陽(yáng)性病人。氨氣與人體的健康密切相關(guān)，測(cè)量人體呼吸中微量氨氣在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中具有很大的前景。本文在研究氨氣和二氧化碳在呼氣中的相關(guān)性中，考查可否用氨氣代替二氧化碳來(lái)診斷幽門螺桿菌感染。雖然本文的數(shù)據(jù)表明用此方法暫還不能有效區(qū)分幽門螺桿菌的陽(yáng)性病人和陰性病人，但是在國(guó)外此方法有過(guò)記載的，

44、由于本文所用的采氣收集器是改裝的，目前國(guó)內(nèi)測(cè)量人體呼吸中微量氨氣的儀器還沒(méi)有，國(guó)外也很少，沒(méi)有專門生產(chǎn)商設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，敏感性會(huì)相對(duì)差很多，再加上干擾氨氣的因素很多，氨氣吸附性很強(qiáng)，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，可能需要引進(jìn)相關(guān)的高精度儀器和做進(jìn)一步的研究。而適合低濃度氣體標(biāo)本快速而又準(zhǔn)確的定量方法在最近今年才有較大進(jìn)展。探索過(guò)的方法有離子選擇性氨電極、聚吡咯氨敏電阻傳感器、選擇離子流管質(zhì)譜、激光氨傳感器、光纖氨傳感器等,后兩種方法可能有臨床發(fā)展前途。感染的檢測(cè)診斷方法日趨增多、成熟和完善。理想的檢測(cè)方法應(yīng)是快速、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷、特異、敏感、價(jià)廉、患者易接受14。非侵入性試驗(yàn)是診斷Hp感染的發(fā)展方向，日

45、新月異的分子生物學(xué)技術(shù)和各學(xué)科間更加緊密地結(jié)合，使Hp的非侵入性檢測(cè)研究領(lǐng)域具有更廣闊的前景，無(wú)創(chuàng)傷，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)將廣泛應(yīng)用于臨床對(duì)Hp的診斷?？梢灶A(yù)言的是，一旦通過(guò)改進(jìn)呼氣氨的采集和測(cè)試方法使得NH3呼氣口氣（呼氣）試驗(yàn)成為重復(fù)好的可靠的檢驗(yàn)方法的話，輝煌的13C和14C標(biāo)記尿素呼氣試驗(yàn)、以及它們的利弊之爭(zhēng)都將成為歷史。附錄A：蒸餾水的制備：稀硫酸溶液：取5.7ml濃硫酸用水稀釋到100ml。高錳酸鉀溶液：稱取0.33g高錳酸鉀于100ml水中。于普通蒸餾水中（約1000ml）加1ml稀硫酸溶液和1ml高錳酸鉀，蒸餾，前50ml的粗餾水可棄，取后蒸餾出來(lái)的水。附錄B：用碘量法標(biāo)定次氯酸鈉原

46、液的濃度：鹽酸溶液50（V/V）：量取25ml鹽酸溶于25ml水中。C（1/2NaS2O3）=0.100mol/L：稱取1.58gNa2S2O3 溶于200ml水中。新配置的淀粉指示劑（5g/L）：稱取1g淀粉溶于煮沸的200ml水中。稱取2g碘化鉀（KI）于250ml碘量瓶中，加水50ml溶解，加1.00ml次氯酸鈉（NaClO）試劑，再加0.5ml鹽酸溶液50%（V/V），搖勻，暗處放置44min。用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液C（1/2NaS2O3）=0.100mol/L。滴定析出的碘，至溶液呈黃色時(shí)，加1ml新配制的淀粉指示劑（5g/L），繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛剛褪去，即為終點(diǎn)，記錄所用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)

47、溶液體積，按公式（4）計(jì)算次氯酸鈉溶液的濃度。C（NaClO）=C（1/2NaS2O3）×V/1.00×2（4）式中：C（NaClO）次氯酸鈉試劑的濃度，mol/L；C（1/2NaS2O3）硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，ml。經(jīng)計(jì)算可知次氯酸鈉原液的濃度?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1王偉岸，岳恒志.幽門螺桿菌相關(guān)疾病.消化系疾病診斷新概念B.科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003.4.2Martin J.Blaser.An Endangered Species in the stomach.Scientific American,pp24-31,February 2

48、0053Graham DY,Klein PD,Evans DJ Jr,et al.Campylobacter pylori detected noninvasively by the 13C-urea breath test.Lancet.1987,1(8543):1174-7.4Bell GD,Weri J,Harrison G.Morden A,et al. 14C-urea bteath analysis,a non-invasive test for Campylobacter pylori in the stomach.Lancet.1987Jun 13;1(8546):1367-8

49、.5Dune CDR,Black M,Cowell DC,et al.Ammoia vapour in the mouth as a diagnostic marker for Helicobacter pylori infection:preliminary“proof of principle”pharmacological investigation.Bri J Biomed Sci2001;58:66-75.6DAVID J.KEARNEY,MD,TODD HUBBARD,and DAVID PUTNAM,PhD.Breath Ammonia Measurenment in Helicobacter pylori Infection.Digestive Diseases and Science,Vol.47,No.11(November 2002),pp.25323-2530. 7李紹英，曾述柏，于令弟.環(huán)境污染與監(jiān)測(cè).哈爾濱工程大學(xué)出版社.1995,第2版，72.8 NEPHROLUX：Breath Ammonia Analyzer，9鄭春生,王建清,楊南,景作亮,張培.一種快速測(cè)定空氣中微量氨的方法.天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 第24卷第3期2004年9月.10室內(nèi)環(huán)境空氣質(zhì)量監(jiān)