禽病學實驗實習指導書20109修訂

1、禽禽病學實驗實習指導書編者：陳建紅 司興奎 張濟培佛山科學技術(shù)學院動物醫(yī)學系禽病學課程組二0一0年9月1 / 35修訂說明禽病學實驗實習指導書以佛山科學技術(shù)學院原禽病學實驗指導書為基礎，以佛山科學技術(shù)學院禽病學實驗教學大綱（2007版）及禽病學教學實習大綱（2007版）為依據(jù)作刪減修訂。目前，本實驗實習指導書的實驗指導部分包括“家禽的尸體剖檢及病料采取”、“家禽具有血凝性病毒病的免疫監(jiān)測”、“雞白痢與小鵝瘟的血清學診斷”、“鴨疫里默氏桿菌病的實驗診斷”4個內(nèi)容（共8學時）；教學實習指導包括“雞新城疫的實驗診斷”1個內(nèi)容（18學時）。本實驗、實習體現(xiàn)了病禽剖檢、病料采取、血清學試驗、病毒分離鑒定

2、和病原菌分離鑒定等禽病診斷的基本技術(shù)，學生能認真操作并結(jié)合禽病學相關(guān)技術(shù)書籍進行學習，將有益于其在禽病學實驗技術(shù)方面打下必要的基礎。本指導書適合于獸醫(yī)專業(yè)本科(或?qū)？?禽病學課程實驗實習指導，亦適合于獸醫(yī)工作人員臨床操作時參考。2 / 35目 錄第一部分 禽病學實驗指導實驗一 家禽的尸體剖檢及病料采取實驗二 家禽具有血凝性病毒病的免疫監(jiān)測實驗三 雞白痢與小鵝瘟的血清學診斷實驗四 鴨疫里默氏桿菌病的實驗診斷第二部分 禽病學教學實習指導雞新城疫的實驗診斷 3 / 35第一部分實 驗 指 導4 / 35實驗一 家禽的尸體剖檢及病料采取一、實驗目的掌握家禽尸體剖檢、病料采取及病原分離的具體方法。二、實

3、驗內(nèi)容1病禽的剖檢；2病料的采取與病原菌的分離。三、實驗儀器、設備及材料1剖檢病禽的用材：解剖剪、解剖盤、消毒液、洗手盆、毛巾、待檢禽等。2病料采取及病原(細菌、病毒或其他微生物)分離的用材：消毒的小剪刀、小鑷子、滅菌玻璃容器、研缽、酒精棉、酒精燈、接種棒、培養(yǎng)基及上述剖檢用材。四、實驗原理 1家禽機體在健康的情況下，各種組織器官具有正常的形態(tài)，發(fā)病后某些組織器官會發(fā)生特征性的變化，通過病禽剖檢可以為臨床診斷疾病提供依據(jù)。2家禽健康的狀況下體內(nèi)不攜帶病原或毒物，發(fā)病后，通過特定的組織器官作病原分離鑒定或?qū)χ卸静∏葑鞫疚餀z測，可以為實驗診斷禽病提供可靠的依據(jù)。 五、實驗步驟1病禽的剖檢進行剖檢之

4、前，應首先了解發(fā)病禽群的流行病學，臨床癥狀情況，家禽的品種，飼養(yǎng)情況，疫苗的接種情況，發(fā)病后的經(jīng)過和處理方法等等。剖檢時，應注意詳細記錄各器官的病理變化，如同時剖檢多只病死禽，則應注意編號，以免混淆。剖檢基本術(shù)式如下：（1）外貌檢查檢查天然孔：注意口、鼻、眼(包括眼下方的羽毛是否干燥，若濕潤則表明有流淚的可能)有無異常的分泌物，分泌物的量及性狀；注意泄殖腔周圍羽毛有無異常糞便粘污，泄殖腔粘膜的變化及內(nèi)容物的性狀等。檢查皮膚：注意頭、冠、肉髯及身體其他部位的皮膚有無痘疹或結(jié)痂等；是否發(fā)生腐?。粰z查家禽的趾爪，注意有無贅生物、外傷、化膿、失水及脛骨有無變軟等。檢查各關(guān)節(jié)及龍骨：注意各關(guān)節(jié)有無腫脹、

5、變形及長骨、龍骨有無變形、彎曲等表現(xiàn)。檢查病禽的營養(yǎng)狀態(tài)：觸摸感覺病禽胸肌厚薄及龍骨的顯突情況而初步判定家禽的營養(yǎng)情況。（2）體腔檢查 第一步，用消毒水將禽體羽毛浸濕，防止病原擴散及避免羽毛飛揚。 第二步，用剪刀將股內(nèi)側(cè)連接腹側(cè)的皮膚剪開，將兩大腿向外和下方翻壓，直至髖關(guān)節(jié)脫臼，使禽體以背臥位平放于瓷盆上。 第三步，橫向剪開腹部皮膚，使切口與上述股側(cè)皮膚切口相連，握住游離皮膚，向前一直剝離到鎖骨部，檢查皮下組織和胸肌的狀態(tài)。橫向剪開腹肌、腹膜，并沿胸骨的兩側(cè)，向前將各肋骨、鎖骨剪斷，抓住龍骨的后端，用力向前向上翻拉(此時應注意觀察體腔內(nèi)6 / 35各氣囊壁有無混濁、增厚等)，暴露整個體腔的器官

6、。注意體腔有無積液，粘附滲出物及其他異常變化。將腺胃、肌胃、心、肝、脾、肺、腸、腎、卵巢、睪丸、法氏囊等各內(nèi)臟器官先后從體腔摘出作細致檢查，先觀察外表形態(tài)、大小、色澤、質(zhì)度等變化，再分別切開檢查內(nèi)部變化，注意有無炎性腫脹、充血、郁血、出血、潰瘍、壞死或結(jié)節(jié)等。（3）頸部檢查將下頜骨、食道、嗉囊剪開，注意觀察口腔和食道粘膜有無出血、潰瘍、假膜或膿包等；同時，剝離頸部皮膚檢查胸腺(尤其是雛禽)有無出血、萎縮等變化；將小剪刀插入喉頭，剪開氣管和支氣管，檢查喉頭和氣管粘膜有無滲出、充血、出血或潰瘍等。（4）頭部檢查 第一步，眼部檢查。主要觀察眼的角膜有無異常變化及眼結(jié)膜有無出血或潰瘍等。 第二步，鼻竇

7、部檢查。沿額面經(jīng)鼻孔剪開約l3厘米切口，將切口用手分開即可見鼻竇，觀察其有無出血或滲出物的特性。 第三步，腦部檢查。用剪刀將頭部皮膚剪開、以尖剪將整個額骨、顱頂骨剪除，暴露大腦和小腦，先觀察腦膜血管的狀態(tài)，腦膜下有無水腫和積液，然后再以鈍器輕輕撥離，將前端嗅腦、腦下垂體及視神經(jīng)交叉等部逐一剪斷，將整個大腦和小腦摘出，觀察腦實質(zhì)的變化；（5）神經(jīng)檢查主要檢查的神經(jīng)為坐骨神經(jīng)干。將股內(nèi)側(cè)的肌肉鈍性分開即可見乳白色有橫紋的坐骨神經(jīng)干，觀察神經(jīng)干外膜有無水腫或出血及神經(jīng)干的粗細是否均勻等。（6）剖檢時的注意事項 剖檢的場地應盡量遠離行人、水源、禽舍，并選擇易于消毒的地方，避免由于剖檢造成病原擴散。 剖

8、檢前后運載病、死禽只，應采用密封容器，避免沿途遺漏病禽羽毛、分泌物及排泄物等。剖檢完畢，應將尸體深埋或焚化，或作其他無害化處理。對剖檢場地及器械要隨手洗刷消毒。2病料采取與病原菌(毒)分離家禽傳染病的確診，通常必須過實驗室診斷，采取病料與病原分離是實驗診斷的前提。（1）采料時間 病毒性病料、中毒性材料(如肉毒梭菌素中毒)的采取一般應在急性感染期，選擇典型的瀕死病禽，病前不久用過疫苗或經(jīng)抗病毒藥物處理的禽只不宜采料。（2）采取病料的方法：器械消毒：刀、剪：鑷子等采料用具可干熱滅菌或煮沸30分鐘滅菌，注射器等器皿應干熱滅菌或高壓滅菌。采料部位：病料采取的部位應根據(jù)不同疾病相應地采取其臟器或內(nèi)容物，

9、一般應采取病原含量高而污染機會少的實質(zhì)性器官，如肝、腦、脾為好。在無法估計是何種傳染病時，可進行全面采取。各種病料的具體采集方法A病毒性病料的采取與病毒分離：用滅菌剪刀及鑷子剪取含毒量高的組織(通常為肝臟、腦、脾臟、胰臟等實質(zhì)臟器)23克，投入滅菌瓶中，加蓋，有條件的地方可即時將病料用滅菌乳缽研磨，并應用超聲波或反復凍融法裂解細胞，以利于細胞內(nèi)病毒的釋放，加入510倍的滅菌生理鹽水或PBS配成懸液，30008000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1520分鐘，去除沉淀，在每毫升上清液中加入青霉素、鏈霉素(或其他有效抗生素)各20004000IU，置487 / 35C冰箱中感作24小時。經(jīng)無菌檢驗合格后，接種相應

10、的生物學培養(yǎng)基(禽胚或細胞培養(yǎng)物等)作病毒分離培養(yǎng)，觀察感染禽胚死亡及病變情況，收集胚液做進一步鑒定。如果病料采取后不能立即處理時，應直接放入低溫冰箱或相應保存劑(如Hanks液或50的甘油PBS)中，并置于冰箱保存。B細菌性病料中病原菌分離：對于各種細菌性疾病，應在病禽剖解前備好相應的培養(yǎng)基。對營養(yǎng)要求低的病原菌，如大腸桿菌，可用普通瓊脂；對營養(yǎng)要求較高的病原菌，如多殺性巴氏桿菌，可用血液瓊脂等；有特殊要求的病原菌，要使用特殊的培養(yǎng)基和方法進行培養(yǎng)，如鴨疫里氏桿菌、雞副嗜血桿菌等要用巧克力瓊脂在含510CO2的空氣條件下培養(yǎng)；懷疑有雜菌污染的病料，應盡量使用需分離細菌的選擇性培養(yǎng)基；病原含菌

11、量少時應采用液體培養(yǎng)基，或用相應的增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，再進行分離培養(yǎng)；未能確定病原菌的種類時，應同時使用多種培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，以提高病原菌的分離成功率。分離病原菌時，用接種棒直接從病禽體內(nèi)相應臟器釣取病料在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基上接種；如不能即時分離培養(yǎng)，則應以無菌手續(xù)采取病料一小塊投入無菌的保存劑中，置48C保存，并應盡早進行分離培養(yǎng)。病原菌的分離應在急性發(fā)病期和未使用過敏感藥物的前提下進行。C血清學材料：一般都應采取雙相血清，即在發(fā)病初期及后期(病愈期)各采取一份，進行檢驗，以檢查有關(guān)抗體的變化情況。具體方法為：采少量血清時，可用注射器沿向心端的方向從翅靜脈直接采取血液；如需大量

12、血清，則可從心臟采血。血液先放在經(jīng)干熱滅菌的小瓶或其他容器中自然凝固，待其自然析出血清，再將血清移至滅菌容器中凍結(jié)保存?zhèn)溆?。血清若有溶血則會影響試驗結(jié)果的準確性。D組織學材料的采?。汗┎±斫M織切片的材料，應將病禽典型病變部分及其相連的健康組織一并切取，隨即投入10%甲醛中固定備用。E腸道內(nèi)容物材料的采?。河妹蘧€將決定采取內(nèi)容的腸道兩端扎緊，然后剪下置于滅菌容器中，必要時可放入20C保存，并迅速送檢。不論上述哪一種材料，都不應該在死后過長時間(一般不超過死后46小時)采取，否則會對正確的診斷造成一定的影響。所有病料采取后均要貼上標簽。若要送檢時，還要用醫(yī)用膠布或石蠟封口，置于冰瓶中及時送出。六、

13、實驗報告要求1扼要地反映病禽剖檢與病料采取的基本程序。2說明操作的注意事項。 3陳述實驗體會。七、實驗的注意事項(參閱實驗步驟)八、思考題家禽尸體剖檢、病料采取及病原分離的方法與注意事項如何?7 / 35實 驗 二 家禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測一、實驗目的1.掌握血凝性病毒病免疫監(jiān)測的基本方法。2.學會根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測的結(jié)果指導雞群血凝性病毒病免疫接種。二、實驗內(nèi)容 1.紅細胞凝集試驗檢測抗原的HA效價及4個血凝單位抗原的配制。2.紅細胞凝集抑制試驗檢測免疫禽只的HI抗體。3.根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測的結(jié)果指導雞群相應病毒病的免疫接種。三、實驗儀器、設備及材料1.抗原原液：購自標準廠家

14、，根據(jù)監(jiān)測抗體的種類而確定抗原的種類。ND免疫監(jiān)測ND抗原；AI H5免疫監(jiān)測H5抗原；AI H9免疫監(jiān)測H9抗原；EDS76免疫監(jiān)測EDS抗原。2.被檢血清：隨機采取被檢禽群的血液（抽樣比例約為12，或每個禽群抽取2040只），取血液自然凝固后析出的血清作為被檢血清。3.滅菌PBS生理鹽水，PH7.0，按常規(guī)配制。4.紅細胞懸浮液：采取健康公禽（被檢測血清為雞血清時，應采用公雞，被檢血清為鴨、鵝血清時，應采用公鴨）血液（每次可采510mL），抗凝，加滅菌PBS生理鹽水離心洗滌35次（每次離心的速度和時間為3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘，將血漿、白細胞等充分洗去，將沉淀的紅細胞用滅菌PBS生理鹽水

15、稀釋成1懸浮液。該紅細胞懸浮液在4存放，可用35天。注意懸浮液顏色變暗應予棄去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反應板，普通離心機等。（以下內(nèi)容主要以ND的免疫監(jiān)測為例，同學們可依此類推探討其他血凝性病毒病免疫監(jiān)測的相關(guān)技術(shù)）四、實驗原理雞群ND免疫后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗ND中和抗體及紅細胞凝集抑制抗體（HI抗體）。后者在體外可抑制NDV凝集紅細胞的能力。在一系列試管中，將被檢雞血清作連續(xù)稀釋，血清中HI抗體越高，則能使ND病毒凝集紅細胞能力完全抑制的血清稀釋度就越高。由于HI抗體與中和抗體的消長是基本一致的，故通過HI抗體水平的檢測可以達到ND免疫監(jiān)測的目的。五、實驗步驟(一) 紅細胞凝集

16、試驗（微量法檢測ND抗原原液HA效價及配制4個血凝單位ND抗原）1.分裝生理鹽水：用移液器在96孔V型反應板的一排孔上的112孔，每孔加入PBS生理鹽水25uL，換滴頭；2.添加抗原：吸取標準ND抗原原液25uL加入第1孔，換滴頭；3.稀釋抗原：用25uL移液器將第1孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第11孔，從11孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入PBS生理鹽水：向1-12孔加入PBS生理鹽水，每孔25uL；8 / 355.加入紅細胞懸浮液：向1-12孔加入

17、紅細胞懸浮液，每孔25uL；6.靜置感作20-30分鐘，然后判定結(jié)果；7.判定結(jié)果（觀察、判定、記錄反應結(jié)果的相關(guān)概念與方法）“凝集”的概念：觀察反應孔，當一層紅細胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個孔底，判定為“凝集”（將反應板傾斜，無紅細胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”。 “不凝集”的概念：觀察反應孔，當紅細胞完全自然沉降到孔底中央，形成一個邊緣光滑無凝集顆粒的紅圓點，判定為“不凝集”（將反應板傾斜，有紅細胞流淌現(xiàn)象），記錄為“”。ND抗原的血凝效價的概念：凡能使雞紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋度稱為該ND抗原的血凝效價。判定、記錄反應結(jié)果的方法判定、記錄反應結(jié)果時，可繪制一個表格，將試驗情況與結(jié)果判斷作填寫

18、。如下是一個ND抗原原血凝效價測定結(jié)果判定與記錄的例子，可作模仿。孔號123456789101112效價抗原稀析1：24816326412825651210242048PBS對照1：64反應圖像結(jié)果記錄+-84個血凝單位（4HAU）抗原的配制方法依據(jù)ND抗原原液的HA效價，用PBS生理鹽水將該抗原原液稀析為4HAU抗原（用于下述HI試驗）。每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為：該抗原原液效價的倒數(shù)除以4減1。如上例，抗原原液效價為1：64，則，每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為64/4-1=15。（二）紅細胞凝集抑制試驗（微量法）檢測免疫禽只的HI抗體。1分裝PBS生理鹽水：在9

19、6孔反應板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理鹽水25uL;2.向第1孔加入被檢血清；3.稀釋被檢血清: 用25uL移液器將第1孔中的被檢血清與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第10孔，從10孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAU ND抗原溶液，每孔25uL;5加入紅細胞懸液：向第1至第12孔加入1雞紅細胞懸浮液，每孔25uL，室溫中靜置2030分鐘，觀察結(jié)果并記錄。6. 判定結(jié)果（觀察、判定、記錄反應結(jié)果的相關(guān)概念與方法

20、）“凝集”的概念：觀察反應孔，當一層紅細胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個孔底，判定為“凝集”（將反應板傾斜，無紅細胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”，讀作凝集?！巴耆种啤钡母拍睿河^察反應孔，當紅細胞完全不凝集而自然沉降于試管底部中央，形成一個邊緣光滑的紅圓點，邊緣沒有分布紅細胞凝集顆粒，判定為完全抑制，記錄為“”，讀作完全抑制；被檢血清HI效價的概念：凡能使0.25mL 濃度4個凝集單位的ND抗原凝集紅細胞的能力完全抑制的血清最高稀釋度稱為該被檢血清的HI效價。10 / 35判定、記錄反應結(jié)果的方法判定、記錄反應結(jié)果時，可繪制一個表格，將試驗情況與結(jié)果判斷作填寫。如下是2個被檢血清HA效價測定結(jié)果判定與記錄

21、的例子，可作模仿。孔號123456789101112效價血清稀析 度1：2481632641282565121024抗原對照PBS對照1：256血清1反應圖像結(jié)果記錄-+-血清2反應圖像1：64結(jié)果記錄-+-（三）根據(jù)ND等血凝性病毒病免監(jiān)結(jié)果指導雞群相應病毒病免疫接種的步驟1計算禽群ND抗體合格率禽群ND抗體合格率的計算公式：ND抗體合格率=（被檢血清樣品數(shù)-抗體效價低于臨界滴度*的樣品數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)100%。*注：ND抗體效價臨界滴度：雞群可抵抗NDV感染的ND抗體的最低滴度。這是一個由生產(chǎn)實際總結(jié)得出的數(shù)值，可因?qū)嶋H情況的變化而變化。目前，此值通常定為1：32。2.確定禽群抗體合格

22、率的標準 禽群抗體合格率的標準也是一個由生產(chǎn)實際總結(jié)得出的數(shù)值，而且雞的日齡不同其標準有不同。目前各種日齡雞群能夠抵抗ND感染的的抗體合格率參考標準為：1月齡以下的小雞，抗體合格率要求在85以上，且其余15的被檢雞只的抗體水平不低于1:5；中成雞群的抗體合格率應在95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應不低于1:5。3將被檢雞群抗體合格率對照禽群抗體合格率的標準，確定被檢雞群目前的免疫狀況，指導其進一步的免疫接種。 如下為根據(jù)ND等血凝性病毒病免監(jiān)結(jié)果指導雞群相應病毒病免疫接種的一個例子：某后備種雞群，18周齡，共3000只種雞，隨機采血20份，經(jīng)ND HI試驗檢測，各樣品抗體水平情況如下表。

23、請根據(jù)該免監(jiān)結(jié)果，對該指導雞群的ND免疫接種作指導。抗體效價1:640監(jiān)測只數(shù)13316600解：1計算雞群ND抗體合格率（臨界滴度取1：32）：雞群ND抗體合格率（被檢血清樣品數(shù)-抗體效價低于臨界滴度*的樣品數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)10 / 35100%（20-4）/20100%80% 2. 確定禽群抗體合格率的標準：本雞群為中成雞群，中成雞群的抗體合格率標準為95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應不低于1:5。3. 將被檢雞群抗體合格率對照禽群抗體合格率標準，確定被檢雞群目前的免疫狀況： 該被檢雞群的ND抗體合格率為80%，而中成雞群的抗體合格率標準是95%，故可見該雞群目前ND免疫狀況未及

24、格，建議盡快給于ND疫苗的加強免疫接種。六、實驗報告要求1.扼要反映本實驗步驟。2.報告實驗結(jié)果應包括各被檢血清樣品各孔的反應結(jié)果和各被檢血清的HI效價，及應用本試驗結(jié)果指導被檢雞群的ND臨床免疫接種。3.試指出應用本技術(shù)對不同的血凝性病毒病作免疫監(jiān)測時，在材料、方法上有何異同。七、實驗的注意事項 (參閱實驗步驟)八、思考題家禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測技術(shù)有哪些關(guān)鍵點?請作扼要陳述。11 / 35實驗三 雞白痢與小鵝瘟的血清學診斷 本實驗包括雞白痢平板凝集試驗及小鵝瘟瓊脂擴散試驗二部分。實驗三之一 雞白痢平板凝集試驗一、實驗目的1掌握平板凝集試驗的基本原理與操作方法。 2了解平板凝集試驗在診斷

25、、監(jiān)測、控制與凈化雞群雞白痢中的應用。二、實驗內(nèi)容 1雞白痢平板凝集試驗操作。2雞白痢平板凝集試驗在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應用。三、實驗儀器、設備及材料 1雞白痢抗原：是用雞白痢沙門氏桿菌培養(yǎng)物加入0.3的甲醛溶液滅活后，制成每毫升含菌100億的懸浮液，并加入抗凝劑和色素制成。由獸醫(yī)生物制品廠提供。 2雞白痢標準陽性血清：由獸醫(yī)生物制品廠提供。 3被檢血清或全血：采自被檢雞群。 4潔凈玻璃板、微量移液器或滴管、采血針頭、不銹鋼絲環(huán)、混合棒及被檢雞若干只。四、實驗原理在有電解質(zhì)存在的條件下，細菌等顆粒性抗原和特異性抗體相互結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集顆粒（塊），稱為凝集反應。根據(jù)顆粒的大小與出現(xiàn)時間的快慢判定

26、試驗反應結(jié)果。參與反應的抗原與抗體分別稱為凝集原和凝集素。平板凝集試驗具有由于簡易、快速、敏感、特異的特點，長期以來，廣泛用于人畜多種傳染病的快速診斷，在家禽最常用的是雞白痢雞與敗血支原體感染的檢驗。五、實驗步驟1操作程序取一潔凈玻片，用蠟筆劃成若干方格，并編號，將抗原充分振蕩混勻，用移液器或滴管吸取雞白痢抗原，垂直滴一滴(約005mL)于平板各格上，在第一格抗原上滴上雞白痢標準陽性血清一滴，在第二格抗原上滴上陰性血清一滴。其余各格為樣品檢測格（每只雞一格），用針頭刺破被檢雞的翅靜脈或雞冠，用不銹鋼絲環(huán)沾取血液一環(huán)或用移液器吸取血液005mL滴加在抗原滴上，用滅菌牙簽迅速將被檢雞全血與抗原混勻

27、并散開至直徑約為2厘米的薄層后，13 / 35輕輕晃動玻板，觀測至5分鐘，判定結(jié)果并記錄。2結(jié)果判定標準在陽性對照出現(xiàn)100%凝集和陰性對照液體均勻混濁無凝集現(xiàn)象的前提下，抗原與血液或血清混和后，于1分鐘內(nèi)出現(xiàn)很多大塊的凝集顆粒且底液清亮者為強陽性反應，記錄為“#”；13分鐘內(nèi)出現(xiàn)很多大小不等的凝集顆粒且底液略有混濁者為中強度陽性反應，記錄為“+”；34分鐘后，出現(xiàn)少量細微顆粒，-底液較混濁者為弱陽性反應，記錄為“+”；未見凝集現(xiàn)象發(fā)生或在4分鐘以后出現(xiàn)不明顯的凝集現(xiàn)象者為陰性反應，記錄為“一”。六、實驗報告要求 1應將試驗的結(jié)果寫清楚，分析陽性結(jié)果的判斷標準。 2將本試驗在生產(chǎn)中應用及應注意

28、的主要問題列出綱要。 七、實驗注意事項 1雞白痢平板凝集試驗的應用： 雞白痢是流行普遍、危害嚴重的家禽傳染病，其傳播的重要途徑之一是經(jīng)卵垂直傳播。因此，搞好種雞群中對該病的控制甚至凈化工作是防制工作中的重要手段。雞白痢平板凝集試驗以簡便、快捷、特異、敏感等特點在國內(nèi)外普遍用于該病的臨床檢驗，監(jiān)視該病的控制與凈化效果，指導控制與凈化措施的修訂與實施。為更好地發(fā)揮本試驗在疾病控制中的作用，在實施檢驗時應注意如下事項。 2對一般性商品生產(chǎn)種雞群作雞白痢檢疫時應注意以下問題： (1)檢測樣品抽檢比例一般為12。 (2)檢測出的陽性雞只可淘汰也可不淘汰。 (3)檢測的時間間隔對后備雞群，首次檢驗應在40

29、-70日齡，第二次檢測在全面開產(chǎn)后每年檢測23次。 (4)檢測工作一定要配合有效的防疫工作。 (5)檢測后對結(jié)果作統(tǒng)計，計算感染的陽性率并與上次檢驗結(jié)果比較，以便評估上次檢測后相應防疫措施的效果，以便修訂防疫計劃，直至雞群感染率下降至最低水平。 3對以建立凈化雞白痢為目的的SPF雞群作檢疫時應注意以下問題： (1)檢測樣品的比例應為100。 (2)檢測出的陽性雞只應予淘汰。 (3)檢測時間間隔應為每月1次，或根據(jù)具體凈化計劃確定間隔時間。 (4)對陰性雞群實施特別嚴格的隔離、衛(wèi)生消毒措施和藥物防制措施。 (5)雞群完全凈化的基本標準是以最后連續(xù)三次檢測全為陰性，且雞群在該段時間未用過對相應疾病

30、敏感的藥物。 4、注意事項 (1)雞白痢抗原應保存于8-10C、避光、干燥處，使用過程中應不斷搖勻。 (2)雞向痢抗原適用于檢查產(chǎn)蛋母雞及一年以上的公雞，對幼齡雞的敏感性較差。 (3)平板凝集反應應在20以上的室溫下進行。 (4)使用藍紫色雞白痢抗原作試驗，最好襯以白色背景以便于觀察。 (5)本試驗還可以以被檢雞卵黃液作被檢材料，判斷標準同上。八、思考題 1雞自痢平板凝集試驗應注意哪些內(nèi)容，判定結(jié)果的標準如何? 2在生產(chǎn)中為有效控制雞白痢，應結(jié)合雞白痢平板凝集試驗采取哪些措施?13 / 35實驗三之二小鵝瘟瓊脂擴散試驗一、實驗目的了解瓊脂擴散（AGP）試驗的原理，并掌握小鵝瘟（GP）瓊脂擴散試

31、驗的的操作方法和臨床應用的方法。 二、實驗內(nèi)容1GP瓊脂擴散試驗。 三、實驗儀器、設備及材料1標準GP抗原：將已知GPV種毒按110稀釋，接種于12-14日齡的無相應抗體的鵝胚尿囊腔內(nèi)，02mL只，繼續(xù)孵化，每天照蛋，收集接種后72-120小時之間死亡胚，氣室向上靜置4冰箱412小時，收獲尿囊液及具有典型病變的胚體，取l份胚體，2份尿囊液搗碎制成勻漿，加等量三氯甲烷(氯仿)震搖30分鐘，以3500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，吸取上清液裝入透析袋，包埋于干燥硅膠中越夜，至袋內(nèi)溶液完全干燥，向袋內(nèi)加入原液容量1/20的去離子水，使內(nèi)容物溶解，即為沉淀抗原。2標準陽性血清：小鵝瘟高免血清。3被檢抗原：無菌

32、采取具有典型病變的患病雛鵝肝組織，搗碎加2倍量離子水，制備成組織懸液，參照制各標準GP抗原方法用氯仿處理硅膠包埋濃縮加入原懸浮120的去離子水為被檢抗原。4被檢血清：受檢雛鵝血液自然析出的血清。5瓊脂板凝膠制備與打孔： 凝膠配方：瓊脂糖 0.71.2克，氯化鈉 8克，苯酚0.1mL，蒸餾水 100mL。凝集制備：將各種試劑依次加入后，用5.6碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 6.8-7.6，水浴加熱使瓊脂糖充分溶解。將溶化的瓊脂凝膠傾注于清沽的玻板上或平皿，制成厚度約為3毫米的瓊脂凝膠板。注意不要產(chǎn)生氣泡。打孔方法同馬立克氏病瓊脂擴散試驗。打孔：在制備好的瓊脂凝膠扳上打孔，(其打孔圖形按需要而定，一般采用七

33、孔梅花圖形，操作時，先用一張與凝膠板大小相仿的白紙片，按要求畫好打孔圖形，然后，將圖形放在凝膠板底下，用打孔器依樣打孔。四、實驗原理瓊脂擴散試驗(AGP)是血清學沉淀試驗的一種，以瓊脂凝膠作為抗原抗體免疫擴散和形成沉淀反應的載體。瓊脂凝膠的含水量在90以上，能允許分子量在200000以下的大分子物質(zhì)自由通過和擴散，絕大多數(shù)的可溶性抗原與免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝膠內(nèi)自由擴散。若特異的抗原、抗體在凝膠中各以其固有的擴散系數(shù)擴散，當兩者在比例最合適的區(qū)域內(nèi)相遇，反應生成的沉淀物的顆粒較大，停留在凝膠中不再擴散14 / 35，即發(fā)生沉淀反應形成不透明的白色沉淀線。小鵝瘟瓊脂擴

34、散試驗，可用標準抗原檢測血清抗體，亦可用標準血清檢測GP抗原，前者陽性檢出率為100，后者檢出率達50以上。五、實驗步驟 1操作程序方法一：用GB標準抗原檢測受檢血清GB抗體 用移液管吸取標準GB抗原加入中心孔內(nèi)，外周任何兩個相對孔加入GB標準陽性血清，其余各外周孔加入各被檢鵝的血清，容量以平孔面為度，注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點樣順序。所有樣本加入完畢，放入濕盒35-37恒溫中過夜，次日（24h）觀察并記錄結(jié)果。方法二：用GB標準陽性血清檢測GB抗原 用移液器吸取GB標準陽性血清加入中心孔內(nèi)，外周任何相對的兩孔加入標準GB抗原，其余外周孔分別加入受檢鵝組織處理液，加入量以平孔面為度

35、。注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點樣順序。 所有樣品加完后，放入溫盒置35-37恒溫箱中過夜，次日觀察并記錄結(jié)果。3結(jié)果判定 若受檢血清有GB特異抗體或受檢組織含有GB病毒抗原，則在抗原與抗體孔之間產(chǎn)生肉眼可見的清晰的白色沉淀線，此為陽性反應。相反，如抗原、抗體之間不出現(xiàn)沉淀線則為陰性。 沉淀線一般出現(xiàn)在抗原抗體孔之中間，但有時由于抗原濃度與抗體濃度不一，沉淀線往往偏近抗原孔或抗體孔，有時可能出現(xiàn)一條以上的沉淀線，這些情況均屬陽性反應。如果被檢孔沒有出現(xiàn)白色沉淀線，但鄰接的陽性對照孔的沉淀線末端向該被檢孔內(nèi)側(cè)偏彎，可認為該被檢孔樣品為陽性：若鄰近的陽性對照孔的沉淀線末端向該被檢孔直伸或一

36、向其外側(cè)偏彎，或該被檢孔雖然有沉淀線，但該沉淀線與陽性對照孔沉淀線交叉(屬非特異性沉淀線)，則此被檢樣品為陰性。 理論上，大多數(shù)傳染病都可應用AGP試驗作檢驗，目前常應用AGP試驗檢測的家禽傳染病還有雞馬立克氏病、傳染性法氏囊病、家禽腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)、滑液囊霉形體病、禽流感、禽霍亂等，基本原理和方法同上，具體操作可按試劑說明書進行。六、實驗報告要求 1說明瓊擴試驗的基本原理、方法。 2準確報告本次試驗的結(jié)果，分析存在的問題。 3說明本試驗還可以應用于哪些家禽傳染病的檢驗。七、實驗注意事項 1配制瓊脂凝膠時，瓊脂濃度的很重要，要根據(jù)經(jīng)驗而定，瓊脂濃度較大時，制成的瓊脂膠較硬，較易打孔，但過硬

37、的凝膠板容易在反應過程中千裂，而且由于密度大，還會影響樣本的擴散速度；而濃度太小時，瓊脂凝膠板則很軟，難于打孔，而且打孔后，孔內(nèi)容易滲出水來，影響加樣量；氣溫高時，濃度應大些，氣溫低時，濃度應小些。通常濃度為0.651.2o 2為了避免打孔時孔周邊瓊脂脫離漏底，可在制各瓊脂板前，將玻璃板浸入充分溶化的瓊脂凝膠液中，取出放在恒溫箱中烘干。再行倒板，這樣由于玻璃板面較粗糙，與瓊脂結(jié)合較牢，打孔時孔周瓊脂不易脫離。15 / 35 3點樣時，其加樣量應統(tǒng)一以加至各孔滿為標準，不要時多時少。如果抗原抗體的比例不當，最易影響反應結(jié)果。 4反應溫度必須始終相對恒定，否則可能會造成假陽性。 5觀察結(jié)果最好在日

38、光燈下進行，必要時可借助放大鏡。八、思考題 1家禽傳染病的AGP試驗基本操作方法與注意事項如何?結(jié)果判定方法如何? 2本方法?？捎糜谀男┘仪莶〉臋z測?實驗四 鴨疫里默氏桿菌病的實驗診斷一、實驗目的1了解鴨疫里默氏桿菌病的實驗診斷程序與方法。 2熟悉鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特點、培養(yǎng)性狀、生化特征和致病性。二、實驗內(nèi)容 1. 鴨疫里默氏桿菌病的臨床癥狀與病理變化觀察。 2鴨疫里默氏桿菌病的病原分離和培養(yǎng)。 3鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)特性與細菌形態(tài)觀察。 4鴨疫里默氏桿菌的生化特性觀察。 三、實驗儀器、設備及材料 1解剖剪、鑷子、解剖盤、接種棒、酒精燈、酒精棉球、一次性手套、滅菌棉簽、1ml注射器、放大鏡、

39、香柏油、擦鏡紙、顯微鏡、生化培養(yǎng)箱等。 2試驗動物、鮮血瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、滅能小牛血清、微量生化發(fā)酵管等、革蘭氏染色液等。四、實驗原理根據(jù)鴨疫里默氏桿菌的特征病理變化、培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)和生化特征，可以同其他細菌性病原導致的家禽傳染病鑒別；但分離菌株是否具有致病力須采用敏感動物進行人工致病試驗。五、實驗步驟 1. 鴨疫里默氏桿菌病的臨床癥狀與病理變化觀察認真觀察實驗鴨只的臨床癥狀后進行詳細系統(tǒng)的解剖，觀察病鴨的病理變化。發(fā)生鴨疫里默氏桿菌病病鴨表現(xiàn)出該病的特征癥狀與病變，病鴨主要特征表現(xiàn)為精神沉郁、濕眼圈，鼻竇部腫脹，跗關(guān)節(jié)腫脹，中樞神經(jīng)紊亂，共濟失調(diào)；剖檢可見纖維素性滲出性心包炎、肝周炎

40、和氣囊炎，部分病鴨可見鼻竇腔有黃白色干酪樣滲出物。 2鴨疫里默氏桿菌病的病原分離和培養(yǎng)。 在急性敗血癥期，細菌在病鴨各器官組織，如心血、腦、氣囊、肝臟、肺、骨髓和病變滲出物中均可分離到，而前三種器官最適合細菌分離。無菌操作剪開病鴨腹腔和頭部顱骨，分別從心血、肝臟和腦進行細菌分離，劃線接種鮮血瓊脂平板（或巧克力瓊脂、胰酶大豆瓊脂），置燭缸或厭氧培養(yǎng)箱37培養(yǎng)24-36小時，觀察細菌生長情況。 3鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)性狀與細菌形態(tài)觀察。培養(yǎng)特性 鴨疫里默氏桿菌在鮮血瓊脂、巧克力瓊脂和胰酶大豆瓊脂上生長良好，在血液瓊脂上經(jīng)37培養(yǎng)24小時，可形成1-2.5mm、圓形、凸起、邊緣光滑、閃光或奶油狀菌落1

41、7 / 35，不溶血。在血液肉湯中經(jīng)37培養(yǎng)24小時，可見上下一致渾濁，管底無或僅有少量灰白色沉淀物。在麥康凱瓊脂上不生長。細菌形態(tài) 將鴨疫里默氏桿菌分離菌株的1824小時純固體培養(yǎng)物按常規(guī)進行革蘭氏與瑞氏染色，普通光學顯微鏡下（油鏡）觀察菌體形態(tài)。鴨疫里默氏桿菌為革蘭氏陰性、不運動、不形成芽孢的桿菌，大小為（1-5）m（0.3-0.5）m，單個或成雙存在，液體培養(yǎng)可見絲狀長達11-24m。瑞士染色呈兩極著色。 4鴨疫里默氏桿菌的生化特性觀察。將接種環(huán)拉直并燒滅菌后（稍冷卻）挑取血液瓊脂平板分離菌的24小時培養(yǎng)的單菌落接種細菌微量生化反應管，發(fā)酵管開口端用膠布封口，盲端向上3045度角放置燭缸

42、37培養(yǎng)24-36小時，觀察發(fā)酵管內(nèi)液體的顏色變化。鴨疫里默氏桿菌不發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇。吲哚和硫化氫試驗、硝酸鹽還原及枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性。六、實驗報告要求1扼要反映鴨疫里默氏桿菌病病鴨的的病原分離、細菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性檢驗的實驗步驟。 2準確報告本次試驗的結(jié)果，分析存在的問題。七、實驗注意事項 1注意鴨疫里默氏桿菌的染色方法及顯微鏡下的形態(tài)特點。 2注意禽鴨疫里默氏桿菌的培養(yǎng)特性與生化特性。八、思考題 1鴨疫里默氏桿菌病的實驗診斷的基本方法如何?2鴨疫里默氏桿菌病的培養(yǎng)特性與生化特性如何?17 / 35第二部分教學實習指導18 / 35雞新城

43、疫的實驗診斷1 實習目的要求通過本課程實習，掌握雞新城疫常規(guī)實驗診斷原理、方法，并可據(jù)此開展對其他家禽病毒性傳染病的實驗診斷。2 實驗原理NDV感染雞通常可表現(xiàn)呼吸困難、嗉囔積液、頭冠紫黑等特征癥狀，出現(xiàn)腺胃、肌胃出血，盲腸扁桃體腫大、出血，泄殖腔出血等特征病理變化。ND病毒可大量存在于肝、脾、腦的器官和呼吸道、消化道分泌物中并可在雞胚上增殖，使雞胚感染致死。感染胚液（病毒）可以凝集雞等動物的紅細胞，該凝集能力可以被特異抗體抑制。根據(jù)本病毒以上特征，采用雞胚從疑似ND病雞病料中分離增殖病毒，經(jīng)HA、HI試驗和人工發(fā)病試驗等，可以鑒定本病毒，而對雞新城疫作出確診。3 實驗路線病雞的剖檢與病料采取

44、處理-病毒的分離培養(yǎng)-病毒的鑒定-實驗結(jié)果-實驗結(jié)論。4 實驗主要用材4.1 ND血清，適量，HI效價為1：32，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，凍結(jié)保存?zhèn)溆谩?.2 疑似ND病雞： 2只（死活各1），病雞30日齡左右。10d齡曾以IV系弱毒疫苗飲水免疫，約28日齡開始發(fā)病，病雞表現(xiàn)厭食、呼吸困難、嗉囔腫大、頭冠紫黑等癥狀，死亡率達30%。發(fā)病后曾采用抗生素治療效果不理想。4.3 病禽尸體剖檢、病料采集與處理的用材：剖檢盆、消毒劑、剪刀、毛巾、鑷子、酒精棉、酒精燈；滅菌的研缽、棉簽、西林瓶（若干）、PBS生理鹽水（配方見4.6）、510ml注射器超濾器、離心管（若干）與離心機等。4.4 病毒分離增殖培養(yǎng)

45、用材：10日齡健康雞胚(來源于ND低免母雞群)10只；恒溫培養(yǎng)箱；1毫升注射器、打孔器、西林瓶等滅菌備用；酒精棉球、碘酊棉球、石蠟、暗室；普通冰箱等。4.5 病毒鑒定用材（HA、HI試驗用材）：包括被檢病毒、滅菌PBS生理鹽水、1%紅細胞懸浮液（配方見4.7）、25L 移液器，96孔V型反應板等。19 / 354.6 PBS的配制：按PBS配方準確稱取試劑（NaCl 4g；Kcl 0.1g；Na2HPO4 1.45g；KH2PO4 0.1g）溶于400mL蒸餾水中過濾測試PH值高壓滅菌備用。4.7 紅細胞懸液配制(包括公雞的采血) ：用5ml注射器吸取1 ml抗凝劑采取公禽血液4ml搖勻注入離

46、心管加入PBS鹽水洗滌3000rpm，15分鐘，重復用PBS洗滌2次量取沉淀的紅細胞加入99倍PBS稀釋成1懸浮液48保存?zhèn)溆谩? 實驗方法5.1病雞剖檢與病料采取處理5.1.1 病雞的剖檢5.1.1.1 病禽的體表檢查（包括天然孔、皮膚各關(guān)節(jié)及營養(yǎng)狀態(tài)的檢查）；5.1.1.2 體表的消毒：用消毒水將親體羽毛浸濕，以防止病原擴散及避免羽毛飛揚；5.1.1.3 皮下打開與檢查：用剪刀將股內(nèi)側(cè)連接腹側(cè)的皮膚剪開，將兩腿向外和下方翻壓，直至股關(guān)節(jié)脫臼，使禽體被臥位平放于瓷盆上。橫向剪開腹部皮膚，使切口與上述股側(cè)皮膚切口相連，握住有游離皮膚，向前一直剝落到鎖骨部，觀察皮下肌肉有沒有出血、失水等現(xiàn)象；5

47、.1.1.4 體腔打開與檢查：用點燃的酒精棉在以被打開的肌肉上充分消毒，橫向剪開腹肌、腹膜，并沿胸骨的兩側(cè)，向前將各肋骨、鎖骨剪斷，抓住龍骨的后端，用力向前向上翻拉，暴露整個體腔的器官并作器官表面檢查；5.1.1.5 內(nèi)臟摘出與檢查：將內(nèi)臟器官小心摘除移至體腔外，依次觀察檢查體腔及其附著器官和摘除移出器官。5.1.1.6 頭頸部與法氏囊的檢查。5.1.2 病料采取處理5.1.2.1 病雞（活）口腔拭子采取與處理：用滅菌棉簽從病雞口腔氣管內(nèi)拭取粘液折取拭子頭部置于滅菌西林瓶內(nèi)加入3-5ml PBS生理鹽水（含適量慶大霉素）震蕩置4-8待作無菌檢驗（樣品簡稱拭子懸液）。5.1.2.2 病雞(死)組

48、織病料的采取與處理：于上述剖檢過程病雞打開體腔后，經(jīng)無菌手續(xù)采取肝、脾、腦至研砵 充分研磨加15-20倍PBS生理鹽水（含適量慶大霉素）震蕩離心取上清液置4-8待作無菌檢驗（樣品簡稱組織懸液）。5.1.2.3 病料上清液的無菌檢驗及超濾：用1ml注射器分別吸取拭子懸液及組織懸液0.2ml于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，作無菌檢驗（注意做好標記與記錄）次日早上觀察無菌檢驗結(jié)果并記錄，剔除菌檢不合格樣品，合格樣品待作接種雞胚。5.2 病毒分離培養(yǎng)5.2.1 禽胚的準備(消毒與定位等)：準備約37溫水適量加入適量福爾馬林溶液配備消毒溫水洗滌雞胚在暗室中檢查雞胚健康情況，剔除不健康胚用蠟筆畫出氣室與接種部位繼續(xù)孵化

49、。5.2.2 病毒的接種：照胚，剔除不健康胚胚蛋氣室與接種部位消毒病料的接種（0.2ml/只雞胚，其中拭子懸液接種適量，組織懸液接種適量）封口繼續(xù)孵化以后每天照胚2次（每次及時檢出死胚置48保存待檢），直至接種后72小時。20 / 355.3 病毒的鑒定5.3.1 感染雞胚的剖檢與胚液收集：雞胚消毒剪開氣室殼、膜剔除細菌污染胚刺破羊水膜檢查雞胚胚體病變每只胚分別收集胚液置疫苗瓶中記錄胚液的具體來源（該胚接種液種類，死/活，污染與否），備作HA檢測。5.3.2 胚液的HA檢測：選擇疑似病毒感染胚胚液作HA檢測，其基本步驟如下述“1）7）”及表1：1）分裝PBS生理鹽水；（1-12孔，25ul）；2）第一孔加25ul被檢病毒（胚液）；3）稀釋被檢病毒：1-11孔作倍比稀釋；4）加入PBS生理鹽水：（1-12孔，25ul）；5）加入紅細胞懸液；（1-12孔，25ul）；6）靜置15-20min7) 判定結(jié)果（讀出各胚胚液HA效價并記錄）表1 紅細胞凝集（HA）試驗（微量法） （單位：l）孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 122 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 PBS對照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2