第五中藥制劑分析生物堿

1、第五章第五章 中藥制劑中各類化學成分分析中藥制劑中各類化學成分分析 第一節(jié)第一節(jié) 含生物堿（含生物堿（alkaloid）類成分的分析）類成分的分析一、概述一、概述廣義上是指生物界所有含廣義上是指生物界所有含N的堿性天然的堿性天然有機物，大多具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮有機物，大多具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮原子多在環(huán)內(nèi)，多數(shù)具有光學活性，有原子多在環(huán)內(nèi)，多數(shù)具有光學活性，有特殊而較顯著的生理活性。特殊而較顯著的生理活性。 生物堿的分布生物堿的分布 生物堿是中藥中重要的有效成分之一，至少有生物堿是中藥中重要的有效成分之一，至少有50多科，多科，120屬以上植物中有生物堿存在，以屬以上植物中有生物堿存在，以雙

2、子葉植物最多，其次是單子葉植物、裸子植雙子葉植物最多，其次是單子葉植物、裸子植物。物。含生物堿量多的科有罌粟科、防已科、茄科、含生物堿量多的科有罌粟科、防已科、茄科、小檗科、毛茛科、蕓香科、夾竹桃科、馬錢科小檗科、毛茛科、蕓香科、夾竹桃科、馬錢科及茜草科等，及茜草科等，中藥有三尖杉、麻黃、黃連、黃中藥有三尖杉、麻黃、黃連、黃柏、烏頭、延胡索、粉防已、顛茄、洋金花、柏、烏頭、延胡索、粉防已、顛茄、洋金花、貝母、百部等。貝母、百部等。物理性質(zhì)物理性質(zhì)二、生物堿的理化性質(zhì)二、生物堿的理化性質(zhì)溶解度溶解度多數(shù)極性較小，屬于親脂性堿，游離狀態(tài)下多數(shù)極性較小，屬于親脂性堿，游離狀態(tài)下幾乎不溶于水。成鹽后則

3、水溶性增加，易溶幾乎不溶于水。成鹽后則水溶性增加，易溶于水及醇中于水及醇中，不溶或難溶于苯、氯仿、乙醚不溶或難溶于苯、氯仿、乙醚等。等。生物堿和其鹽這一相反的溶解性質(zhì)可以生物堿和其鹽這一相反的溶解性質(zhì)可以用于它的提取、分離和精制。用于它的提取、分離和精制。個別生物堿溶解性能較特殊，如麻黃堿既溶個別生物堿溶解性能較特殊，如麻黃堿既溶于水又可溶于有機溶劑；另小檗堿鹽酸鹽難于水又可溶于有機溶劑；另小檗堿鹽酸鹽難溶于水，但硫酸鹽溶解度增加溶于水，但硫酸鹽溶解度增加10倍。季胺堿、倍。季胺堿、酰胺型堿和一些含極性基團較多的游離生物酰胺型堿和一些含極性基團較多的游離生物堿則能溶于水。堿則能溶于水。酸堿性酸

4、堿性生物堿結(jié)構(gòu)中含氮，多呈堿性。能與無生物堿結(jié)構(gòu)中含氮，多呈堿性。能與無機酸、有機酸成鹽機酸、有機酸成鹽N： + H+X- N：H+X-堿性強弱為：季胺堿性強弱為：季胺 叔胺叔胺 仲胺仲胺 伯胺伯胺 酰胺酰胺沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)三、含生物堿類成分中藥制劑的定性鑒別三、含生物堿類成分中藥制劑的定性鑒別（一）生物堿樣品的制備（一）生物堿樣品的制備常用的提取溶劑系統(tǒng)常用的提取溶劑系統(tǒng) 非極性溶劑系統(tǒng)：一般先用非極性溶劑系統(tǒng)：一般先用10%的氫氧的氫氧化銨、碳酸氫鈉或氫氧化鈉堿化，使生物化銨、碳酸氫鈉或氫氧化鈉堿化，使生物鹽游離，后用氯仿或乙醚提取，缺點是不鹽游離，后用氯仿或乙醚提取，缺點是不能提出水溶性

5、生物堿。能提出水溶性生物堿。極性溶劑系統(tǒng)：極性較大的生物堿可用極性溶劑系統(tǒng)：極性較大的生物堿可用中性甲醇、乙醇、酸水（常用中性甲醇、乙醇、酸水（常用0.1%-1%的鹽酸、硫酸等）以及緩沖液提取，的鹽酸、硫酸等）以及緩沖液提取，但提出的雜質(zhì)較多，需凈化。但提出的雜質(zhì)較多，需凈化。 （一）一般理化鑒別（一）一般理化鑒別（二）色譜鑒別（二）色譜鑒別1、薄層色譜法、薄層色譜法吸附劑的選擇吸附劑的選擇：硅膠本身有弱酸性，與生物堿：硅膠本身有弱酸性，與生物堿成鹽，使吸附力增強，若用中性展開系統(tǒng)，其成鹽，使吸附力增強，若用中性展開系統(tǒng)，其Rf值小，易拖尾。值小，易拖尾。一般用堿性展開系統(tǒng)或在一般用堿性展開系

6、統(tǒng)或在中性中加少量堿性溶劑，如二乙胺、氫氧化銨中性中加少量堿性溶劑，如二乙胺、氫氧化銨或用氨水飽和（展開缸中放一小杯氨水）或制或用氨水飽和（展開缸中放一小杯氨水）或制備堿板（在硅膠板中加稀堿溶液）備堿板（在硅膠板中加稀堿溶液）。堿性氧化堿性氧化鋁因本身帶有堿性，故用中性展開劑即可使生鋁因本身帶有堿性，故用中性展開劑即可使生物堿得到很好的分離。物堿得到很好的分離。脂溶性生物堿脂溶性生物堿-用吸附薄層法，用活度較用吸附薄層法，用活度較大的吸附劑如硅膠、氧化鋁。大的吸附劑如硅膠、氧化鋁。水溶性生物堿水溶性生物堿-用硅藻土、纖維素作為支用硅藻土、纖維素作為支持劑，硅膠板也可以持劑，硅膠板也可以展開劑的

7、選擇展開劑的選擇脂溶性生物堿采取極性小的溶劑脂溶性生物堿采取極性小的溶劑水溶性用極性大的溶劑水溶性用極性大的溶劑但一般用混合溶劑較多，單一溶劑少但一般用混合溶劑較多，單一溶劑少顯色劑的選擇顯色劑的選擇某些生物堿本身有顏色，可直接于可見光某些生物堿本身有顏色，可直接于可見光下觀察。下觀察。有紫外吸收的可用紫外檢測。有紫外吸收的可用紫外檢測。但大部分生物堿無色且無熒光，則需噴顯但大部分生物堿無色且無熒光，則需噴顯色劑，色劑，最常用的顯色劑有改良碘化鉍鉀、最常用的顯色劑有改良碘化鉍鉀、碘蒸氣、氨蒸氣碘蒸氣、氨蒸氣2、紙色譜法、紙色譜法游離生物堿游離生物堿甲酰胺為固定相，固定相飽和的甲酰胺為固定相，固

8、定相飽和的有機溶劑為展開劑。有機溶劑為展開劑。 生物堿鹽生物堿鹽濾紙中的水為固定相，濾紙中的水為固定相，BAW系統(tǒng)系統(tǒng)為展開劑。為展開劑。 3、高效液相色譜法、高效液相色譜法4、氣相色譜法、氣相色譜法 四、含生物堿類成分中藥制劑的含量測定四、含生物堿類成分中藥制劑的含量測定（一）總生物堿的含量測定（一）總生物堿的含量測定1、化學分析法、化學分析法（1）酸堿滴定法是利用生物堿含有N原子具有堿性，可用酸滴定。對于不溶于水的游離生物堿一般常溶于過量標準酸液中，再用標準堿回滴對于游離生物堿能溶于水或水-醇溶液中的可直接滴定（2）雙相滴定法指的是水相和有機相是在水及與水不相混溶的有機溶劑中進行滴定，被滴

9、定的待測成分先溶于水相（或有機相）中，一般是水相。滴定時，產(chǎn)生的滴定產(chǎn)物不斷進入有機溶劑中，當?shù)味ㄟ^量時，指示劑即在水相（或有機相）產(chǎn)生顏色變化，或滴定劑本身產(chǎn)生顏色變化指示終點。（3）重量法重量法 多為測定總生物堿的含量，據(jù)游離生物堿和多為測定總生物堿的含量，據(jù)游離生物堿和生物堿鹽在水和水不相溶的有機溶劑中的溶生物堿鹽在水和水不相溶的有機溶劑中的溶解度不同而設(shè)計的；或利用與沉淀試劑反應(yīng)解度不同而設(shè)計的；或利用與沉淀試劑反應(yīng)形成不溶性鹽來設(shè)計形成不溶性鹽來設(shè)計(1) 提取重量法提取重量法(2) 形成不溶性鹽的重量法形成不溶性鹽的重量法2、 分光光度法分光光度法用于測定中藥制劑中總生物堿的含量，

10、一些生用于測定中藥制劑中總生物堿的含量，一些生物堿具有特殊的結(jié)構(gòu)，本身具有顏色、或與氧物堿具有特殊的結(jié)構(gòu)，本身具有顏色、或與氧化劑產(chǎn)生顏色，或因所具有的官能團與試劑反化劑產(chǎn)生顏色，或因所具有的官能團與試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。如利用其通性與雷氏鹽、苦味酸應(yīng)產(chǎn)生顏色。如利用其通性與雷氏鹽、苦味酸產(chǎn)生有色化合物，在一定的波長條件下進行比產(chǎn)生有色化合物，在一定的波長條件下進行比色測定。色測定。（1）直接測定法）直接測定法（2）離子對萃取比色法）離子對萃取比色法酸性染料比色法酸性染料比色法在一定在一定pH介質(zhì)中，生物堿介質(zhì)中，生物堿B可與氫離子可與氫離子H+結(jié)結(jié)合生成生物堿鹽的陽離子合生成生物堿鹽的陽離子BH

11、+，而酸性染料，而酸性染料在此條件下解離為陰離子在此條件下解離為陰離子In-, ,則陰陽離子能則陰陽離子能定量定量結(jié)合生成有色化合物（離子對）。結(jié)合生成有色化合物（離子對）。再用合適的有機溶劑將該離子對提取，測定再用合適的有機溶劑將該離子對提取，測定其吸收度值，進而對生物堿定量。其吸收度值，進而對生物堿定量。注意事項注意事項：1、選擇適當?shù)倪x擇適當?shù)膒H 則生物堿成鹽，則生物堿成鹽，成為陽離子成為陽離子BH+而酸性染料成為陰離子而酸性染料成為陰離子In-，陰陽，陰陽離子可結(jié)合。如離子可結(jié)合。如pH太低，則水相酸性強，雖然生太低，則水相酸性強，雖然生物堿成鹽，但酸性染料亦以酸的形式存在；物堿成鹽

12、，但酸性染料亦以酸的形式存在；pH太太高則水相堿性強，生物堿以游離狀態(tài)存在，酸性染高則水相堿性強，生物堿以游離狀態(tài)存在，酸性染料以離子形式存在。都不能使陰陽離子定量地結(jié)合。料以離子形式存在。都不能使陰陽離子定量地結(jié)合。2、酸性染料酸性染料的選擇的選擇 常用的有溴酚藍、溴甲酚常用的有溴酚藍、溴甲酚綠、溴麝香草酚藍等綠、溴麝香草酚藍等3、合適的合適的有機溶劑有機溶劑 要求對生物堿與酸性染料要求對生物堿與酸性染料的結(jié)合物有很好的溶解度。氯仿、二氯甲烷的結(jié)合物有很好的溶解度。氯仿、二氯甲烷苦味酸鹽法苦味酸鹽法利用生物堿與苦味酸鹽形成離子對而呈色。利用生物堿與苦味酸鹽形成離子對而呈色。適用于在弱酸性或中

13、性溶液中能與苦味酸定適用于在弱酸性或中性溶液中能與苦味酸定量發(fā)生沉淀的生物堿。量發(fā)生沉淀的生物堿。雷氏鹽比色法雷氏鹽比色法 雷氏鹽又稱硫氰酸鉻銨雷氏鹽又稱硫氰酸鉻銨(NH4Cr(NH3)2(SCN)4.H2O)中藥制劑經(jīng)過凈化處理后，其中生物堿與雷氏鹽能中藥制劑經(jīng)過凈化處理后，其中生物堿與雷氏鹽能生成難溶于水而易溶于丙酮的紅色絡(luò)合物，可于生成難溶于水而易溶于丙酮的紅色絡(luò)合物，可于520526nm波長處比色測定其吸收度，再換算波長處比色測定其吸收度，再換算為生物堿的含量。也可通過間接測定濾液中殘存的為生物堿的含量。也可通過間接測定濾液中殘存的過量雷氏鹽的方法計算含量。過量雷氏鹽的方法計算含量。（

14、三）色譜法（三）色譜法1、高效液相色譜法、高效液相色譜法離子對色譜、正相色譜、反相色譜。離子對色譜、正相色譜、反相色譜。局限性：局限性：1、由于硅膠上具有弱酸性硅醇基，易吸附、由于硅膠上具有弱酸性硅醇基，易吸附產(chǎn)生拖尾，常在溶劑中加入堿性改善劑，如產(chǎn)生拖尾，常在溶劑中加入堿性改善劑，如氨、二乙胺、三乙胺，但在堿性系統(tǒng)下硅膠氨、二乙胺、三乙胺，但在堿性系統(tǒng)下硅膠G的穩(wěn)定性較差的穩(wěn)定性較差2、因使用的多數(shù)流動相含有相對高比例的、因使用的多數(shù)流動相含有相對高比例的極性改善劑，如醇或堿，以及樣品中存在的極性改善劑，如醇或堿，以及樣品中存在的水或流動相中的水，易使硅膠浸潤而失活。水或流動相中的水，易使硅

15、膠浸潤而失活。正相正相HPLC：（1 1）、流動相方面的改進）、流動相方面的改進 A A：加入：加入硅醇基抑制劑硅醇基抑制劑，可在流動相中抑制或掩，可在流動相中抑制或掩蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使生物堿易蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使生物堿易出峰，峰形好。出峰，峰形好。最常用的有最常用的有二乙胺、三乙胺二乙胺、三乙胺；B B：加入：加入離子對試劑離子對試劑，使其與生物堿生成離子對，使其與生物堿生成離子對而掩蔽其堿性基團，從而不會與固定相表面的硅而掩蔽其堿性基團，從而不會與固定相表面的硅醇基作用；醇基作用；常用辛烷磺酸鈉或十二烷基磺酸鈉表常用辛烷磺酸鈉或十二烷基磺酸鈉表面活性劑。面活性

16、劑。 注意：柱子及時清洗注意：柱子及時清洗反相反相HPLC的改進：的改進：C C：也可以加入：也可以加入季銨鹽試季銨鹽試劑劑， RR3 3SioH + A RSioH + A R3 3SioH.ASioH.A硅醇基硅醇基 季銨鹽季銨鹽 復(fù)合物復(fù)合物連續(xù)添加季銨鹽時，平衡向右，因而被分連續(xù)添加季銨鹽時，平衡向右，因而被分離的生物堿和硅醇基之間的作用被阻礙，離的生物堿和硅醇基之間的作用被阻礙，從而使生物堿得到很好的分離。從而使生物堿得到很好的分離。 常用有溴化四甲基胺常用有溴化四甲基胺D：在流動相中加入一定濃度電解質(zhì)在流動相中加入一定濃度電解質(zhì)緩沖鹽緩沖鹽，可改變流動相離子強度，穩(wěn)定可改變流動相離

17、子強度，穩(wěn)定pH值及促進離值及促進離子對作用，從而改善峰形及分離效果。子對作用，從而改善峰形及分離效果。 通常用通常用磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液，但操作時由于存，但操作時由于存在鹽，做過后應(yīng)充分洗柱，以免腐蝕柱子。在鹽，做過后應(yīng)充分洗柱，以免腐蝕柱子。（2）、固定相方面的改進）、固定相方面的改進A：選擇：選擇C鏈較短的鍵合相硅膠為固定相鏈較短的鍵合相硅膠為固定相，如，如C8比比C18好，原因是由于硅烷的好，原因是由于硅烷的C鏈較短則覆鏈較短則覆蓋硅膠的表面較好，只有較少的游離硅醇基。蓋硅膠的表面較好，只有較少的游離硅醇基。B：封尾技術(shù)可使填料的鍵合更徹底，常用三封尾技術(shù)可使填料的鍵合更徹底，常用三甲基氯硅烷（甲基氯硅烷（TMCS）處理，可減少殘余羥基，）處理，可減少殘余羥基，增加單體覆蓋度。增加單體覆蓋度。（3）、增加流動相的脂溶性）、增加流動相的脂溶性（