結核桿菌對異煙肼藥物的敏感性試驗

1、結核桿菌對異煙肼藥物的敏感性試驗     作者：汪保國陳思東周衛(wèi)平張勝周勇【摘要】目的研究結核分枝桿菌對異煙肼藥物的敏感性狀況，為結核病的防治提供理論依據(jù)。方法采用直接涂片檢查法和培養(yǎng)法。對肺結核患者的痰液進行檢查，陽性標本經(jīng)抗酸染色鏡檢確認后，采用絕對濃度法的間接法進行耐藥性測定。結果 131例疑似肺結核患者痰標本中，直接涂片法檢出陽性標本21例，陽性檢出率為160%（21/131）；培養(yǎng)法共檢出陽性標本56例，陽性檢出率為 427%（56/131）。比較2種檢測方法的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。培養(yǎng)法高于直接涂片法。5

2、6株結核桿菌標本進行異煙肼的藥物敏感性試驗，其中有47株發(fā)生耐藥，耐藥率為839%，且都是高濃度耐藥。結論結核分枝桿菌對異煙肼的初始耐藥率處于較高水平，必須進一步加強對耐藥結核桿菌的監(jiān)控。?【關鍵詞】 結核分枝桿菌；異煙肼；藥敏試驗?【Abstract】 Objective To study the situation and trend of isoniazid resistance for tuberculosis and provide the basis for tuberculosis prevention and treatment. Methods Sputum fluid wa

3、s examined by direct smear and culture on modified lowenstein-jensen medium after treatment with 4% NaOH. Then the positive samples were subjected to susceptibility testing against isoniazid using absolute concentration method. ResultsThe positive rate with culturing and smearing method was 427%（56/

4、131）, and the positive rate with direct smearing method was 160%（21/131）. The prevalence of primary drug resistance was 839%(47/56), and at high concentration level.ConclusionThe rate of primary drug against Isoniazid still to be at a higher level. Monioring of the resistance of tuberculosis should

5、be strengthened.?【Key words】 Mycobacterium tuberculosis; Isoniazid; Drug resistance analysis結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌感染引起的人畜共患的嚴重傳染病，也是人類單一致病菌感染導致死亡率最高的細菌感染性疾病。結核病的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內均有上升的趨勢而且由于獲得性免疫系統(tǒng)缺陷綜合征-艾滋病的流行，在非洲、美洲許多國家及某些亞洲國家出現(xiàn)結核桿菌和艾滋病毒雙重感染的患者，這是結核病第3次回升的新動向。WHO預測，若不采取有效措施，未來的十年中，全球將有3000多萬人死于結核病1。?

6、結核病是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關注的公共衛(wèi)生問題和社會問題，世界衛(wèi)生組織已將結核病作為重點控制的傳染病之一。全球80%的結核病患者分布在22個結核病高負擔國家，中國是其中之一，結核病患者數(shù)僅次于印度居世界第2位2。但是，近10年來，臨床上發(fā)現(xiàn)抗結核藥物的耐藥性對結核病化療效果的影響日益嚴重，結核病患者由于受到耐藥性結核分枝桿菌的感染，使本來容易治愈的疾病變?yōu)殡y治性疾病甚至導致化療失敗3。?耐多藥結核菌株的增加，給結核病的防治帶來了極大的困難。耐多藥結核桿菌的產(chǎn)生是由于不規(guī)范的治療和控制方法引起。理論上耐多藥菌株的出現(xiàn)可由細菌對耐單藥的逐一獲得而形成，也可有表現(xiàn)為多價作用的單基因突

7、變而造成。臨床上已證實耐單藥的形成是由于不合理治療所致，同時也強有力支持耐單藥的順次獲得是形成耐多藥的最可能機制。因此合理進行臨床治療極為關鍵。正確的藥敏試驗結果是指導臨床合理用藥的前提，所以藥敏試驗在結核病防治中有極重要的作用4。?為了解廣州地區(qū)結核桿菌對異煙肼耐藥的狀況，為臨床合理、聯(lián)合用藥提供依據(jù)，特作本研究?，F(xiàn)將結果報告如下。?1 資料和方法?11 病例來源 2005年11月至2006年5月間，在廣州市白云區(qū)某醫(yī)院、深圳市寶安區(qū)某醫(yī)院檢查為疑似肺結核患者的痰液，共131例。病例發(fā)病前均未服用過抗結核藥物。結核分枝參考菌株為H37Rv敏感株，由中國結核病防治臨床中心國家參比實驗室提供。?

8、12 痰液直接涂片法 用接種環(huán)取膿性痰12環(huán)，均勻涂于載玻片上，待自然干燥，微火焰固定，抗酸染色鏡檢。?13 分枝桿菌培養(yǎng)法 ?131 培養(yǎng)基 為酸性羅氏培養(yǎng)基。成分：谷氨酸納(純度95%以上) 72 g, KH2PO?4 14 g,MgSO?47H20 024 g, 枸椽酸鎂 06 g,甘油12 ml,蒸餾水600 ml,馬鈴薯淀粉 30 g,新鮮雞卵液1000 ml,2%孔雀綠水溶液 20 ml。?132 制備方法 各種鹽類成分溶解后，加馬鈴薯淀粉，混勻，沸水浴煮沸1 h呈糊狀(不時搖動，防凝塊)，待冷后，加經(jīng)消毒紗布過濾的新鮮雞卵液，混勻，再加入2%孔雀綠水溶液，混勻，分裝于經(jīng)121高壓

9、滅菌的中型試管，每管加培養(yǎng)基7 m1，斜置血清凝固器內12層，斜面高度占試管2/3,90 15 h或85 1 h間歇2次。冷卻后，37無菌試驗24 h。培養(yǎng)基斜面顏色鮮艷，表面光滑無泡，有一定韌性和酸堿緩沖能力,4保存，1個月內使用。?133 接種方法 取痰標本12 ml，加入2倍量4%NaOH，于室溫下放置30 min（期間振蕩23次）后，取前處理消化后痰液01 ml，無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上，每份標本同時接種兩支酸性改良羅氏培養(yǎng)基，放37恒溫箱培養(yǎng)。每周觀察1次,記錄細菌生長情況，至8周為止。?14 藥敏試驗 具體操作參照結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程5。?141 藥物 異煙肼為純品，結晶狀。

10、由上?？笊锛夹g有限公司提供。?    142 培養(yǎng)基 為改良羅氏培養(yǎng)基。成分：谷氨酸鈉（純度95%以上）72 g；磷酸二氫鉀24 g；硫酸鎂024 g；枸櫞酸鎂06 g；丙三醇12 ml；蒸餾水600 ml；馬鈴薯淀粉30 g；新鮮雞卵液1000 ml；2%孔雀綠水溶液20 ml5。?143 制備方法 制備方法同酸性羅氏培養(yǎng)基。只是在培養(yǎng)基制成后分裝試管之前，按每100 ml培養(yǎng)基加入1 ml異煙肼藥液，混勻，再行分裝中型試管，加溫凝固成斜面5。?144 異煙肼藥液的配制 異煙肼藥物為純品，生物效價為1000 g/mg，配制2個濃度的含藥培養(yǎng)基，藥物

11、濃度為：1、10 g/ml，根據(jù)標本例數(shù)，每支試管含培養(yǎng)基7 ml，計算所需培養(yǎng)基的量，再得出所需藥物量。每100 ml的培養(yǎng)基加入1 ml的藥液。所得培養(yǎng)基即為含藥培養(yǎng)基5。?145 菌懸液的制備 取在酸性羅氏培養(yǎng)基生長旺盛的23周的菌落，用磨菌器仔細研磨成乳液樣菌液、以05%Tween-80生理鹽水稀釋至1 mg/ml的均勻菌液，備用。?146 接種 將菌懸液10倍稀釋至10?-2? mg/ml，取01 mg接種于含藥及對照培養(yǎng)基內，37培養(yǎng)，培養(yǎng)2周報告結果5。?147 質量控制 每批試驗應以結核分枝桿菌參考菌株（H37RV敏感株）10?-5? mg檢測含藥培養(yǎng)基質量。?148 結果判定

12、經(jīng)培養(yǎng)對照，培養(yǎng)基菌落>200個且無融合，含藥培養(yǎng)基上無生長為（-），并可報告敏感；含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)<20個則實報菌落數(shù)；含藥培養(yǎng)基上菌落生長數(shù)占斜面1/4為（+）；占1/2為（+）；占1/3為（+）；菌落布滿整個斜面為（+），均可報告低度耐藥或高度耐藥。對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)在50200個時需重復試驗5。?15 統(tǒng)計學方法 兩種檢測法陽性檢出率的比較2檢驗，以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。?2 結果?21 痰涂片情況 131例疑似肺結核患者標本中，共有21例痰涂片為陽性。陽性率為160%。?22 痰培養(yǎng)結果 131例標本中，有菌生長60例，經(jīng)抗酸染色鏡檢后，共有56例為結核分枝

13、桿菌，陽性檢出率為427%。結果見表1。?23 藥敏試驗結果 質控H37Rv生長結果：對照培養(yǎng)基為4+，高、低濃度含藥培養(yǎng)基均不生長，為敏感。故所配制的培養(yǎng)基質量合格，能用于藥物敏感性測試。?56株痰培養(yǎng)陽性標本中，其中47株的對照培養(yǎng)基全部生長，菌落數(shù)均在200以上無融合。故56例試驗標本中共有47例出現(xiàn)耐藥，總耐藥率為839%，并且所有耐藥菌株均為高濃度耐藥。見表2。?3 討論?耐藥性試驗不僅是臨床選擇和評價化療方案的依據(jù)，更是流行病學的重要指標6。我國1990年流調初始耐藥率為異煙肼96%。近年來，結核分枝桿菌異煙肼耐藥性呈上升趨勢，美國紐約的結核分枝桿菌臨床分離株中，26%對異煙肼耐藥

14、，我國異煙肼初始耐藥率為281%，繼發(fā)耐藥率為411%。本研究中的異煙肼敏感性試驗初始耐藥率為839%，其原因除化療管理不足外，不排除其中的未被發(fā)現(xiàn)的獲得性耐藥菌株的影響。如此高的初始耐藥率，嚴重地削弱化學治療效果7。更說明了本地區(qū)結核病耐藥情況嚴重，應引起警惕。?異煙肼是酰肼類化學合成藥物，抗菌作用強，試管內對結核分支桿菌和牛分支桿菌的敏感范圍為00202 g/ml。高于現(xiàn)有各種抗結核藥物，且其在組織內滲透能力強，能快速轉運至菌體內，在干酪病變內充分擴散。自1952年異煙肼首次用于結核病的臨床治療以來，一直作為抗結核治療的首選藥物，至今已有50多年的歷史4。而對異煙肼的耐藥意味著一方面由于患

15、者對異煙肼耐藥，臨床上須加大藥劑量或改用其他抗結核藥物，使患者的療程延長，增加患者的危險和經(jīng)濟負擔；另一方面也加大了耐藥性結核桿菌傳播的機會，使人群暴露于耐藥結核桿菌的危險性增加8。?研究表明，結核桿菌對異煙肼產(chǎn)生耐藥性是由于編碼過氧化氫-過氧化物酶(該酶能激活INH藥物前體)的KatG基因突變和編碼參與分枝菌酸合成的enoy1-ACP還原酶(該酶為INA活化形式作用的靶位)的inhA基因突變所致9。由于結核分枝桿菌產(chǎn)生自然耐藥變異的頻率很低，造成耐藥的主要原因是治療過程中不合理的聯(lián)合用藥、間斷用藥、不執(zhí)行歸口管理與治療等。因此，在今后的結核病防治工作中，重點為社會性綜合防治措施，抓好結核患者

16、的發(fā)現(xiàn)、登記、管理和合理治療。堅持在直接面視短程化療(DOTS)下10，早期、適量、規(guī)律、全程、聯(lián)合應用敏感藥物或抗結核藥物復合劑，輔以免疫劑治療，使得在強化期內迅速、大量殺滅結核菌，使痰菌轉陰11。對于耐藥病例防治，須堅持聯(lián)合用藥的原則，根據(jù)既往用藥史和藥物敏感性試驗制定個體化治療方案。結核病防治部門也應加強對耐藥菌株的檢測，掌握結核病耐藥趨勢，以指導臨床合理、有效用藥3。針對本研究中的高耐藥率，應優(yōu)先使用抗結核藥物復合劑，輔以免疫劑治療,以提高結核病治療的有效率，達到控制結核病的目的。?參考文獻1 Shimao T. Global situation of TB and its contr

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