細(xì)胞工程-第11章-mdf

1、第第11章章 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)二、植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史二、植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史1 1、萌芽階段萌芽階段：( (從從2020世紀(jì)初到世紀(jì)初到3030年代中）年代中） 1838-18391838-1839年，德國科學(xué)家年，德國科學(xué)家SchleideSchleide 和和SchwannSchwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。19021902年，德國植物學(xué)家年，德國植物學(xué)家HaberlandtHaberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出植物根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出植物細(xì)胞全能性（細(xì)胞全能性（totipotencytotipotency）理論。）理

2、論。19041904年，年，HanningHanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。19221922年，年，Knudson Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗?？朔浞N克服其種子發(fā)芽困難的問題子發(fā)芽困難的問題1925年：年：Laibach亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種玉米成熟胚的培養(yǎng)玉米成熟胚的培養(yǎng)Haberlandt：觀點(diǎn)：觀點(diǎn)：貢獻(xiàn)：貢獻(xiàn)： 提出細(xì)胞全能性提出細(xì)胞全能性首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)高等植物的組織和器官可高等植物的組織和器官可以分割成單個(gè)細(xì)胞以分割成單個(gè)細(xì)胞

3、19341934年，美國植物生理學(xué)家年，美國植物生理學(xué)家White White 用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。2 2、奠基階段奠基階段（從（從2020世紀(jì)世紀(jì)3030年代末到年代末到5050年代中）年代中）1934年：年：Gautherete培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了Callus1937年：年：White發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3種種B族維生素和族維生素和IAA對(duì)植物生長有用對(duì)植物生長有用1939年：年：Gautherete培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功

4、培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功1939年：年：White培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段原形成層成功培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段原形成層成功1939年：年：Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功組織培養(yǎng)的奠基人組織培養(yǎng)的奠基人- White3、快速發(fā)展和應(yīng)用階段快速發(fā)展和應(yīng)用階段（從（從20世紀(jì)世紀(jì)50年代末至今）年代末至今）l 19581958年，英國科學(xué)家年，英國科學(xué)家Steward Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體胚狀體并分化為完整的小植并分化為完整的小植株。這是株。這是第一次實(shí)現(xiàn)

5、人工體細(xì)胞胚培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)的第一次實(shí)現(xiàn)人工體細(xì)胞胚培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)的第一個(gè)突破。第一個(gè)突破。l 19601960年英國學(xué)者年英國學(xué)者CockingCocking用用酶法分離原生質(zhì)體成功酶法分離原生質(zhì)體成功。這是。這是植物組織培養(yǎng)的第二個(gè)突破。植物組織培養(yǎng)的第二個(gè)突破。l 19621962年，年，MurashingeMurashinge 和和SkoogSkoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的仍被廣泛使用的MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基。l 1964-19661964-1966年，印度科學(xué)家年，印度科學(xué)家GuhaGuha 和和MaheswariMaheswari 在曼

6、陀羅花在曼陀羅花藥培養(yǎng)中藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。l19721972年，年，Carlson Carlson 通過兩個(gè)種的煙草通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，培養(yǎng)，獲得了獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。野胡蘿卜的胚狀體野胡蘿卜的胚狀體 原生質(zhì)體原生質(zhì)體單倍體育種單倍體育種原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合第11章 植物組織培養(yǎng) 11.1 植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)的理論基礎(chǔ) 11.1.1 植物的無性繁殖 11.1.2 植物細(xì)胞全能性理論 11.1.3 植物細(xì)胞的脫分化與再分化 11.2 植物組織培養(yǎng)的過程的過程 11.2.1

7、 植物材料的清洗與消毒 11.2.2 培養(yǎng)基 11.2.3 接種 11.2.4 種質(zhì)保存 11.2.5 植物組織和細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)11.1植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)的理論基礎(chǔ) 植物組織培養(yǎng)（植物組織培養(yǎng)（Tissue culture） 是指用是指用無菌無菌方法使植物體的離體方法使植物體的離體（in vitro)器官、組織和細(xì)胞在器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（稱之為離體培養(yǎng)（In vitro culture）或試）或試管培養(yǎng)。管培養(yǎng)。器官（器官（organ)：根、莖、葉、花、果實(shí)、種子：根、莖、葉

8、、花、果實(shí)、種子組織（組織（tissue)：花藥、胚珠、胚、胚乳、形成層等：花藥、胚珠、胚、胚乳、形成層等11.1.1植物的無性繁殖 一、有性生殖 1、有性生殖是生物界中最普遍的一種生殖方式。它是指兩個(gè)性細(xì)胞兩兩結(jié)合形成合子，進(jìn)而形成新的個(gè)體。性細(xì)胞是通過減數(shù)人裂產(chǎn)生的。 2、進(jìn)行有性生殖的生物，其后代具有了兩個(gè)親本的遺傳物質(zhì)，因而具有更大的生活力和變異性。無性生殖無性生殖是不經(jīng)生殖細(xì)胞的兩兩結(jié)合，由母體直接產(chǎn)生新個(gè)體的方式。從本質(zhì)上講，是由體細(xì)胞進(jìn)行的繁殖就是無性生殖。 植物無性生殖的方式主要是營養(yǎng)生殖- 由植物營養(yǎng)器官（根、莖、葉）的一部分，在與母體脫落后，發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體。 如馬鈴薯的

9、塊莖、薊的根、秋海棠的葉 營養(yǎng)生殖甘薯甘薯 馬鈴薯馬鈴薯營養(yǎng)生殖用腋芽來繁殖的甘蔗長有小地下莖的的芋頭營養(yǎng)生殖落地生根吊蘭大蒜summary 植物中常常有性繁殖和無性繁殖共存,在有性繁殖受到破壞的時(shí)候(花被破壞)通常會(huì)選擇無性繁殖. 有性繁殖使個(gè)體的基因發(fā)生變異,能更好的適應(yīng)環(huán)境, 無性繁殖往往花費(fèi)較少的能量,且成功機(jī)會(huì)高。11.1.2 植物細(xì)胞全能性理論 定義：定義：1902年由年由Haberlandt提出，提出，即植物體細(xì)胞在即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。株的能力。 20世紀(jì)世紀(jì)80年代：年代：每一個(gè)植物

10、細(xì)胞具有該植物的全部每一個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株細(xì)胞全能性的相對(duì)性細(xì)胞全能性的相對(duì)性: 細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物直接產(chǎn)生植物; 動(dòng)植細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的動(dòng)植細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異差異.離體細(xì)胞離體

11、細(xì)胞具有生命的特征屬性，在全能性的基具有生命的特征屬性，在全能性的基礎(chǔ)上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細(xì)胞礎(chǔ)上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細(xì)胞經(jīng)歷經(jīng)歷脫分化脫分化（dedifferentiation）和）和再分化再分化（redifferentiation）過程，可形成）過程，可形成再生植物再生植物。 植物細(xì)胞全能性理論是植物植物細(xì)胞全能性理論是植物組織培養(yǎng)的核心理論組織培養(yǎng)的核心理論11.1.3 植物細(xì)胞的脫分化與再分化 1、細(xì)胞分化、細(xì)胞分化（cellular differentiation）。 含義：由一個(gè)或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性的差異的過程。 隨著

12、分化發(fā)育的進(jìn)程，細(xì)胞逐漸喪失其分化潛能。從全能全能性到多能多能性，再到單能單能性，最后失去分化潛能成為成熟定型的細(xì)胞。植物細(xì)胞的分化 細(xì)胞分化細(xì)胞分化是組是組織分化織分化和和器官分化器官分化的基的基礎(chǔ)礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。 細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。2、植物細(xì)胞的脫分化脫分化：脫分化：由由高度分化高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞在一的植物器官、組織或細(xì)胞在一定條件下，定條件下，重新重新獲得分裂能力，產(chǎn)生獲得分裂能力，產(chǎn)生愈傷愈傷組織的組織的過程，又稱過程，又稱去分化去分化。 或者說，離體培養(yǎng)條

13、件下，一個(gè)或者說，離體培養(yǎng)條件下，一個(gè)已分化已分化的細(xì)胞的細(xì)胞回回復(fù)復(fù)到原始到原始無分化無分化狀態(tài)或狀態(tài)或分生分生組織細(xì)胞狀態(tài)或組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性胚性細(xì)胞細(xì)胞的狀態(tài)的過程。的狀態(tài)的過程。細(xì)胞全能性細(xì)胞全能性脫分化脫分化個(gè)體再生個(gè)體再生再分化再分化細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo) 愈傷組織：愈傷組織：脫分化后脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂分裂，產(chǎn)，產(chǎn)生生無組織結(jié)構(gòu)無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性無明顯極性的、的、松散的細(xì)胞團(tuán)松散的細(xì)胞團(tuán)。 愈傷組織的誘導(dǎo)

14、是組培的第一步和關(guān)鍵步驟。愈傷組織的誘導(dǎo)是組培的第一步和關(guān)鍵步驟。 外植體外植體（靜止細(xì)胞）（靜止細(xì)胞）培養(yǎng)基培養(yǎng)基誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織愈傷組織(分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞)活化活化細(xì)胞細(xì)胞愈傷組織的種類愈傷組織的種類: 分為：分為：胚性胚性愈傷組織愈傷組織 （Embryonenic callus）和和非胚性非胚性愈傷組織。愈傷組織。 胚性愈傷組織：能形成體細(xì)胞胚的愈傷組織胚性愈傷組織：能形成體細(xì)胞胚的愈傷組織 。 質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，顏色有乳白色或黃色，表面具球形顆粒，其生長緩慢；從細(xì)胞學(xué)來看，胚性愈傷組織由等直徑細(xì)胞組成，細(xì)胞較小，原生質(zhì)濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性強(qiáng)。 非胚性愈傷組織：不能分化形

15、成體細(xì)胞胚。非胚性愈傷組織：不能分化形成體細(xì)胞胚。資料資料黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織愈傷組織愈傷組織（callus）培養(yǎng)培養(yǎng)（）、愈傷組織的形成（）、愈傷組織的形成 在細(xì)胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下在細(xì)胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細(xì)胞往往是形成愈傷組織。愈傷組織的細(xì)胞往往是異質(zhì)異質(zhì)性的，性的，無明顯極性無明顯極性，其形成過程可，其形成過程可分為分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。u 誘導(dǎo)期（起動(dòng)期）：誘導(dǎo)期（起動(dòng)期）：是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。細(xì)胞大小幾不變，內(nèi)部是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。細(xì)胞大小幾不變，內(nèi)部發(fā)生生理生

16、化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。u 分裂期：分裂期：外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞必分化，及時(shí)結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞必分化，及時(shí)轉(zhuǎn)移，其可無限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)。轉(zhuǎn)移，其可無限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)。u 分化期：分化期：細(xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)細(xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。胞。愈傷組織的保持愈傷組織的保持 轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)接在多數(shù)情況下，隨

17、著繼代培養(yǎng)在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加代數(shù)增加和培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間的延長時(shí)間的延長，Callus長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低甚至死亡。所以在此之前，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接至甚至死亡。所以在此之前，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮新鮮培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基上。 主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變；主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變； 生理生理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對(duì)外源生長物因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對(duì)外源生長物質(zhì)的敏感性改變。后者可以通過調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)。質(zhì)的敏感性改變。后者可以通過調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)。4、愈傷組織形態(tài)發(fā)生、

18、愈傷組織形態(tài)發(fā)生 （1）過程：）過程：外層外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部內(nèi)部較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形成發(fā)生改變，形成微管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)。微管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)。 （2）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。發(fā)生。 3、細(xì)胞的再分化與器官發(fā)生、細(xì)胞的再分化與器官發(fā)生 細(xì)胞的再分化（細(xì)胞的再分化（redifferentiation) 是脫分化后的分生細(xì)胞（是脫分化后的分生細(xì)胞（愈傷愈傷組織）在一定組織）在一定條件下，條件下，重新分化重新分化為各種類型的細(xì)胞，并進(jìn)為各種類型

19、的細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成一步發(fā)育成完整植株完整植株。高等植物細(xì)胞脫分化和再分化示意圖高等植物細(xì)胞脫分化和再分化示意圖由愈傷組織再分化形成再生植株，可經(jīng)過由愈傷組織再分化形成再生植株，可經(jīng)過 器官發(fā)生器官發(fā)生和和胚狀體發(fā)生胚狀體發(fā)生兩條途徑。兩條途徑。成熟細(xì)胞成熟細(xì)胞分生細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織愈傷組織器器官官發(fā)發(fā)生生胚胚狀狀體體發(fā)發(fā)生生成熟細(xì)胞成熟細(xì)胞脫分化脫分化分裂分裂再分化再分化器官發(fā)生器官發(fā)生 植物的器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的愈傷愈傷組織（組織或細(xì)胞團(tuán)）分化形成不定根不定根（adventitious roots）或不定芽不定芽（adventitious shoots）等器官器官，再進(jìn)一步發(fā)育成完

20、整植株的過程。通過通過器官發(fā)生形成再生植株器官發(fā)生形成再生植株 有三種方式：有三種方式： 第一種方式是第一種方式是先芽后根先芽后根(芽根在不同培養(yǎng)基上芽根在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)誘導(dǎo))； 第二種方式為第二種方式為先根后芽先根后芽(芽根在不同培養(yǎng)基芽根在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)上誘導(dǎo)) ； 第三種方式是在愈傷組織的第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成不同部位形成芽和根芽和根，再通過，再通過維管組織維管組織的聯(lián)系形成完整的聯(lián)系形成完整植株。植株。胚狀體發(fā)生胚狀體發(fā)生 胚狀體胚狀體：在植物細(xì)胞、組織或器官體外培養(yǎng)過程中，由一個(gè)或一些體細(xì)胞經(jīng)過胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，形成的與合子胚相類似的結(jié)構(gòu)?？蛇M(jìn)一步發(fā)育成植株。也叫

21、體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚。 區(qū)別于自然發(fā)生的區(qū)別于自然發(fā)生的珠心胚珠心胚及其他通過無融合及其他通過無融合生殖和由生殖和由合子胚合子胚分裂產(chǎn)生的胚分裂產(chǎn)生的胚 。合子胚：由植物的雌雄配子融合合子胚：由植物的雌雄配子融合形成的合子繼而發(fā)育形成的胚形成的合子繼而發(fā)育形成的胚 合子心型胚合子心型胚 正在萌發(fā)的體胚正在萌發(fā)的體胚 合子胚與體胚比較胚狀體發(fā)生 胚狀體發(fā)生初期的細(xì)胞分裂與合子胚的不同，但分化后的發(fā)育過程與合子胚的類似。 雙子葉植物胚胎發(fā)生：雙子葉植物胚胎發(fā)生： 合子原胚球形胚心型胚魚雷胚子葉胚合子原胚球形胚心型胚魚雷胚子葉胚 單子葉植物胚胎發(fā)生：單子葉植物胚胎發(fā)生： 合子原胚球形胚盾型胚子葉胚合子

22、原胚球形胚盾型胚子葉胚 胚狀體產(chǎn)生的方式有：胚狀體產(chǎn)生的方式有： 直接由器官上發(fā)生直接由器官上發(fā)生。 培養(yǎng)物先形成愈傷組織，由培養(yǎng)物先形成愈傷組織，由愈傷組織再分化形成胚狀體愈傷組織再分化形成胚狀體。 在花藥培養(yǎng)中，可由在花藥培養(yǎng)中，可由小孢子發(fā)育成胚狀體小孢子發(fā)育成胚狀體。 胚狀體發(fā)生（續(xù)） 在一個(gè)材料的各部位，其發(fā)生和發(fā)育過程中一般是不同步的。所以在一個(gè)材料中同時(shí)可以見到各個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的胚狀體。 經(jīng)過愈傷組織的胚胎發(fā)生需要三個(gè)培養(yǎng)階段經(jīng)過愈傷組織的胚胎發(fā)生需要三個(gè)培養(yǎng)階段：第一階段是誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；第二階段是誘導(dǎo)愈傷組織胚性化；第三階段是體細(xì)胞胚形成?；ㄒ梭w細(xì)胞胚發(fā)育的不同階段

23、花椰菜體細(xì)胞胚發(fā)育的不同階段影響脫分化與再分化的因素 內(nèi)因：外植體遺傳性狀；外植體生理狀況 不同生理年齡和不同季節(jié)都會(huì)有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會(huì)有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。 外因： （1）營養(yǎng)條件（無機(jī)物，有機(jī)物，激素等） （2）環(huán)境條件 (光照，溫度，濕度，培養(yǎng)基酸 堿度，培養(yǎng)基滲透壓等)4.植物激素在植物細(xì)胞分化中的作用 生長素影響細(xì)胞壁的強(qiáng)度 ，促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂 ，細(xì)胞分裂素則促進(jìn)細(xì)胞分裂并影響分化方向，二者的配比是影響脫分化和再分化的關(guān)鍵。激動(dòng)素和生長素的比例決定根芽分化的理論。 當(dāng)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素生長素比值 (1)比值高高時(shí)促進(jìn)根根的分化； (2)比值 低低時(shí)促進(jìn)芽芽的分

24、化； (3) 2種激素濃度相當(dāng)相當(dāng)時(shí)， 誘導(dǎo)愈傷組織占愈傷組織占優(yōu)勢或不分化。優(yōu)勢或不分化。激素調(diào)控細(xì)胞分化的機(jī)理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 已初步證明已初步證明生長素生長素處理植物細(xì)胞主要是處理植物細(xì)胞主要是作用于作用于轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)；系統(tǒng)；一般認(rèn)為一般認(rèn)為細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素主要是作用于主要是作用于翻譯翻譯系統(tǒng)。系統(tǒng)。5、影響細(xì)胞分化的其他因素 切割等的機(jī)械傷害；切割切割損傷的刺激，損傷的刺激，促促使細(xì)胞使細(xì)胞增殖增殖。 化學(xué)試劑；(三氯乙醛使分化細(xì)胞重新回到愈傷狀態(tài)) 電離輻射 弱光或黑暗弱光或黑暗條件有條件有利于利于脫分化中的細(xì)胞脫分化中的細(xì)胞分裂分裂。11.2 植物組織培養(yǎng)的過程的過程獲取獲取外植體外植

25、體無菌接種無菌接種誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織的形成的形成試管苗的形成試管苗的形成擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)移栽移栽脫分化脫分化再分化再分化11.2.1 植物材料的清洗與消毒1、材料的選取與清洗與清洗 流程 自來水沖洗5min 中性洗滌劑（洗潔精）水溶液清洗清洗材料， 并用自來水沖洗干凈， 分裝如干凈的三角燒瓶中，備用。 2、外植體消毒 滅菌時(shí)，既要將材料上附著的微生物殺死，同時(shí)又不能傷及材料。 因此，滅菌采用何種藥劑，什么濃度，處理多長時(shí)間，均應(yīng)根據(jù)材料對(duì)藥劑的敏感情況仔細(xì)敲定。 常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較常用表面滅菌劑使用濃度及效果比較滅菌劑滅菌劑使用濃度使用濃度(%)去除的難易去除的難易滅菌時(shí)間

26、滅菌時(shí)間(min)升汞升汞0.11最難最難515次氯酸鈉次氯酸鈉2易易530次氯酸鈣次氯酸鈣910易易530漂白粉飽和溶液漂白粉飽和溶液易易530（雙氧水）（雙氧水）1012最易最易515溴水溴水12易易210酒精酒精7075易易0.22硝酸銀硝酸銀1較難較難530抗生素抗生素450（mg/l）中中3050通常需要注意以下三個(gè)方面： （1）選擇合適的滅菌種類 要考慮滅菌效果，也要摸索滅菌時(shí)間，最好選擇最好選擇滅菌效果好滅菌效果好，又，又容易被去除容易被去除的滅菌劑。的滅菌劑。使用滅菌劑后，一定要用無菌水多次漂洗，否則留在組織上的滅菌劑會(huì)影響外植體的生長。 （2）考慮不同材料對(duì)滅菌劑的耐力不同材

27、料對(duì)滅菌劑的耐力 不同種類的外植體，或處于不同生理狀態(tài)的同一種的外植體，對(duì)滅菌劑產(chǎn)生的反應(yīng)不同。 （3）任何一種滅菌劑對(duì)不同材料如葉片、莖段和根部，浸泡時(shí)間和濃度是不同的，對(duì)任何一種外植體使用滅菌劑滅菌時(shí)，需要任何一種外植體使用滅菌劑滅菌時(shí)，需要做篩選試驗(yàn)做篩選試驗(yàn)，以確定合適的滅菌劑和使用濃度及時(shí)間，才能達(dá)到滅菌的效果。不同培養(yǎng)器官的滅菌順序器官順序滅菌前滅菌中滅菌后莖尖清洗75%酒精酒精3-5min，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入0.1%升汞加吐溫升汞加吐溫8-10min轉(zhuǎn)入無菌水洗轉(zhuǎn)入無菌水洗4次，接次，接種培養(yǎng)基。種培養(yǎng)基。腋芽清洗75%酒精酒精3-5min，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入0.1%升汞加吐溫升汞加吐溫20-3

28、0min，轉(zhuǎn)入無菌水洗轉(zhuǎn)入無菌水洗4次，接次，接種培養(yǎng)基。種培養(yǎng)基?；ɡ?5%酒精酒精6-7min，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入0.1%升汞加吐溫升汞加吐溫8-10min，轉(zhuǎn)入無菌水洗轉(zhuǎn)入無菌水洗4次，接次，接種培養(yǎng)基。種培養(yǎng)基。種子浸種，催芽75%酒精酒精3-5min，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入0.1%升汞加吐溫升汞加吐溫20-30min，轉(zhuǎn)入無菌水洗轉(zhuǎn)入無菌水洗4次，接次，接種培養(yǎng)基。種培養(yǎng)基。11.2.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 (culture medium) 是植物組織植物組織培養(yǎng)的重要營養(yǎng)條件。 在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物組織植物組織對(duì)營 養(yǎng)有不同要求; 同種植物植物不同部位的組織組織對(duì)營 養(yǎng)的要求也不相同 ；1、

29、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基的成分及作用 大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成的。 無機(jī)營養(yǎng)物無機(jī)營養(yǎng)物 無機(jī)營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。磷和硫則常用磷酸鹽和硫酸鹽來提供。鉀是培養(yǎng)基中主要的陽離子，在近代的培養(yǎng)基中，其數(shù)量有逐漸提高的趨勢。而鈣、鈉、鎂的需要?jiǎng)t較少。培養(yǎng)基所需的鈉和氯化物，由鈣鹽、磷酸鹽或微量營養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多以螯合鐵的形式存在，即FeSO4與Na2EDTA（螯合劑）的混合。

30、碳源碳源 培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物以供需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源外，對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。 維生素維生素 在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養(yǎng)基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。 有機(jī)附加物有機(jī)附加物 包括人工合成或天然的有機(jī)附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。另外，瓊脂也是最常用的有機(jī)附加物，它主要是作為培養(yǎng)基的支持物，使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于各種外植體的培養(yǎng)。 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

31、常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)大致包括以下三類： (1)植物生長素類。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。 (2)細(xì)胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動(dòng)素（Kt）。 (3)赤霉素。組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。 2、幾種常用培養(yǎng)基的特點(diǎn)、幾種常用培養(yǎng)基的特點(diǎn) (1) MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 MS培養(yǎng)基是目前普遍使用的培養(yǎng)基。它有較高的無機(jī)鹽濃度，對(duì)保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用

32、來誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，它的液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)能獲得明顯成功。這種培養(yǎng)基中的無機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細(xì)胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，無須再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的明顯特點(diǎn)。 B5培養(yǎng)基。 (2) B5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這是因?yàn)殇@可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用 N6培養(yǎng)基。 N6培養(yǎng)基特別適合于禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)，在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。 3、培養(yǎng)液的配制培養(yǎng)液的配制 【1】. 制備母液制備母液 為了

33、避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)幾十種化學(xué)藥品進(jìn)行稱量，應(yīng)該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時(shí)，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液。 (1)大量元素。 大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時(shí)，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱出并進(jìn)行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達(dá)到1升，此即大量元素母液。 (2)微量元素。 因用量少，為稱量方便和精確起見，應(yīng)配成100倍或1000倍的母液。配制時(shí)，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素

34、母液。 (3)鐵鹽。 鐵鹽要單獨(dú)配制。由硫酸亞鐵(FeSO47H2O) 5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(NaEDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養(yǎng)基，加鐵鹽5毫升。 (4)有機(jī)物質(zhì)。 主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.11.0毫克/毫升)，用時(shí)按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。 (5)植物激素。 最常用的有生長素和細(xì)胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.0110毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制時(shí)要單個(gè)稱量，分別貯藏。 配制植物生長素時(shí)，應(yīng)先按要求濃度稱好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用12毫升0.1molL-1 (摩爾濃度)氫

35、氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細(xì)胞分裂素時(shí)，應(yīng)先用少量0.5或1molL-1的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。 以上各種混合液(母液)或單獨(dú)配制藥品，均應(yīng)放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。 【2】配制培養(yǎng)基的具體操作】配制培養(yǎng)基的具體操作 根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。 將中稱好的瓊脂加蒸餾水300400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。 將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養(yǎng)基。 用

36、1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.8。 將配好的培養(yǎng)基，用漏斗分裝到三角瓶(或試管)中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫上號(hào)碼。瓶中培養(yǎng)基的量約為容量的1/4或1/5。 4、培養(yǎng)基的滅菌與保存、培養(yǎng)基的滅菌與保存培養(yǎng)基配制完畢后，應(yīng)立即滅菌。培養(yǎng)基通常應(yīng)在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在汽相120條件下，滅菌20分鐘。如果沒有高壓蒸汽滅菌鍋，也可采用間歇滅菌法進(jìn)行滅菌，即將培養(yǎng)基煮沸10分鐘，24小時(shí)后再煮沸20分鐘，如此連續(xù)滅菌三次，即可達(dá)到完全滅菌的目的。 濕熱滅菌 培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：

37、在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。 注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。 關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。 按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同 經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基

38、應(yīng)置于10下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基，在45低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應(yīng)超過一個(gè)月。在多數(shù)情況下，應(yīng)在消毒后兩周內(nèi)用完。 11.2.3 接種1、無菌接種步驟： （1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V紙上。 （2）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0.5cm平方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 （3）用灼燒

39、消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1-3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。 2、預(yù)防污染-可按以下步驟進(jìn)行： （1）在接種4小時(shí)前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺

40、菌； （2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈； （3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等； （4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面； （5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干； （6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等； （7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。 11.2.4 種質(zhì)保存種質(zhì)種質(zhì):指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)遞給子代的遺傳物

41、質(zhì)種質(zhì)保存種質(zhì)保存:利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，使個(gè)體中利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，高活所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，高活力，能通過繁殖將遺傳物質(zhì)傳遞下去。力，能通過繁殖將遺傳物質(zhì)傳遞下去。種質(zhì)保存方法 按照保存時(shí)的所設(shè)定的溫度分為： (1)常溫保存常溫保存 (2)常低溫保存常低溫保存 (3)低溫保存低溫保存 (4)超低溫保存超低溫保存（1） 常溫保存溫度溫度:2025改變培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度改變培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度改變培養(yǎng)的環(huán)境條件：降低氧的含量改變培養(yǎng)的環(huán)境條件：降低氧的含量降低無機(jī)鹽濃度降低無機(jī)鹽濃度提高滲透壓：甘露醇、蔗糖提高滲透壓

42、：甘露醇、蔗糖增加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)增加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)覆蓋礦物油覆蓋礦物油降低氧壓降低氧壓l特點(diǎn)特點(diǎn):保存時(shí)間短保存時(shí)間短,1 ,1年轉(zhuǎn)年轉(zhuǎn)335 5次次(2) 常低溫和(3)低溫保存方法方法:常低溫常低溫:015低溫低溫:-800特點(diǎn)特點(diǎn):簡便易行簡便易行,投資小投資小.1年轉(zhuǎn)年轉(zhuǎn)13次次低溫保存改變培養(yǎng)基成分改變培養(yǎng)條件(4) 超低溫保存超低溫保存超低溫保存：也叫冷凍保存，也叫冷凍保存，指在指在-196-196的液氮超低溫的液氮超低溫下使細(xì)胞代謝和生長處于下使細(xì)胞代謝和生長處于基本停止的狀態(tài)，在適宜基本停止的狀態(tài)，在適宜條件下可繁殖，再生出新條件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺的植株，并保

43、持原來的遺傳特性。傳特性。保存原理保存原理 低溫冰凍過程中，如果生物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)低溫冰凍過程中，如果生物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)就遭到不可逆的破壞，導(dǎo)致冰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)就遭到不可逆的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡。植物材料在超低溫條件細(xì)胞和組織死亡。植物材料在超低溫條件下，冰凍過程中避免了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，下，冰凍過程中避免了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，并且在解凍過程中防止細(xì)胞內(nèi)水分次生結(jié)并且在解凍過程中防止細(xì)胞內(nèi)水分次生結(jié)冰而達(dá)到植物材料保存目的。冰而達(dá)到植物材料保存目的。 快速冷凍法快速冷凍法慢速冷凍法慢速冷凍法分步冷凍法分步冷凍法干燥冷凍法干燥冷凍法快速冷凍法快速冷凍法 將要保存的樣品直接置于-196液氮中使之

44、迅速冷卻 。降溫速度為1000 min。 采用該法要求細(xì)胞體積小、 含水量低、液泡化程度低的材料。 慢速冷凍法 將處于0 或其他預(yù)處理溫度的材料，以 12/min的降溫速度從起始溫度降到-100，穩(wěn)定1h 后，投入到液氮保存或以此降溫速度連續(xù)降溫至 -196 的方法。 適宜保存的材料有：成熟的、含有大液泡和含水量高的細(xì)胞，對(duì)于保存在懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞特別有效。 預(yù)冷凍法 預(yù)冷凍法指將植物保存材料放入液氮前，需經(jīng)過短暫 時(shí)間的低溫鍛煉的方法。 可分為兩步冷凍法和逐級(jí)冷凍法。 兩步冷凍法：先慢速降溫到預(yù)冷溫度 (-30 -50 )，停留13小時(shí)后投入液氮。 逐級(jí)冷凍法：逐級(jí)降溫（每級(jí)降溫后停留幾分鐘

45、）直到投入到液氮中。干燥冷凍法 將材料置于2729烘箱內(nèi)降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。 可防止材料因細(xì)胞內(nèi)過度結(jié)冰而凍死。 解凍 方法有： 快速解凍 和 慢速解凍 快速解凍法 ：是指將液氮中保存的材料直接投入到 37-40溫水浴中進(jìn)行解凍。解凍 的升溫速度為500- 750/min，大多數(shù)植 物材料可采用此種方法。 慢速解凍法 ：將液氮中保存的材料先置于0低溫下解凍，再逐漸升至室溫下進(jìn)行解凍的方法。適宜細(xì)胞含水量較低的材料 。 超低溫保存的程序組織材料組織材料預(yù)處理預(yù)處理加冷凍防護(hù)劑加冷凍防護(hù)劑0慢凍法慢凍法-40或或-100預(yù)凍法預(yù)凍法-70-20快凍法快凍法種質(zhì)庫（種質(zhì)庫（-19

46、6）迅速解凍（迅速解凍（3440）再培養(yǎng)再培養(yǎng)細(xì)胞生長、植株再生細(xì)胞生長、植株再生冷凍保存的應(yīng)用前景（意義）1、長期保存種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。、長期保存種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。2、長期保存去病毒的種質(zhì)。、長期保存去病毒的種質(zhì)。3、保存稀有珍貴及瀕危植物的種質(zhì)資源。、保存稀有珍貴及瀕危植物的種質(zhì)資源。4、保存不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單倍體。、保存不穩(wěn)定性的培養(yǎng)物，如單倍體。5、保持培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的能力。、保持培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的能力。6、防止種質(zhì)衰老。、防止種質(zhì)衰老。7、延長花粉壽命，解決不同開花期和異地植物、延長花粉壽命，解決不同開花期和異地植物雜交上的困難。雜交上的困難。8、冷凍解凍過程可篩選抗逆新品種。

47、、冷凍解凍過程可篩選抗逆新品種。9、便于國際間的種質(zhì)交換。、便于國際間的種質(zhì)交換?？偨Y(jié) 植物組織培養(yǎng)的過程一、培養(yǎng)基配制一、培養(yǎng)基配制1、配制幾種母液、配制幾種母液 2、配制培養(yǎng)基、配制培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基滅菌二、培養(yǎng)基滅菌三、接種三、接種四、培養(yǎng)四、培養(yǎng)四、培養(yǎng)四、培養(yǎng)（1）初代培養(yǎng)）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。無性繁殖系包括：莖梢、繁殖系。無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等芽叢、胚狀體和原球莖等 。(2)繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無

48、根繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。 3、生根培養(yǎng)、生根培養(yǎng) 無根苗生根無根苗生根 五、馴化移栽五、馴化移栽11.2.5植物組織和細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)1、規(guī)?；囵B(yǎng)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展 1950年，Bonner用銀膠菊培養(yǎng)物生產(chǎn)橡膠； 迄今，400多種植物細(xì)胞生產(chǎn)600多種次代物； 發(fā)酵罐規(guī)?；囵B(yǎng)植物細(xì)胞，次代物集中于酶類、生物堿、甾體、萜類、色素等，應(yīng)用于藥物、食品、顏料、香精等生產(chǎn)領(lǐng)域。 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求： 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

49、 從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下 3 個(gè)條件： 1 、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。 2 、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3 、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性 （1）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，有纖維素細(xì)胞壁細(xì)胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）細(xì)胞生長的中期及對(duì)數(shù)期易凝聚為直徑較大的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較難；（4）培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大：（5）具有群體效應(yīng)；（6） 因?yàn)橛屑?xì)胞壁, 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；（7）

50、細(xì)胞培養(yǎng)過程有結(jié)構(gòu)與功能全能性,因而易分化,從而導(dǎo)致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)濃度；（8）懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細(xì)胞濃度，否則不生長 植物細(xì)胞培養(yǎng)需要解決的問題 （1）氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；（2）營養(yǎng)物的供應(yīng)；（3）細(xì)胞密度過高引起細(xì)胞團(tuán)聚甚至分化（4）培養(yǎng)過程中細(xì)胞的分化的防止，（5）細(xì)胞取得中微生物的去除；（6）細(xì)胞壁脆性的存在要求培養(yǎng)體系剪切力要小 2、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)系統(tǒng) 按照培養(yǎng)方式分為： 懸浮培養(yǎng) 固定化培養(yǎng) 器官培養(yǎng)（1）懸浮培養(yǎng) 大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采的設(shè)備及控制技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)復(fù)雜的多。 所需的生物反應(yīng)器主

51、要有 ： 機(jī)械攪拌式； 氣壓攪拌式 旋轉(zhuǎn)式機(jī)械攪拌式反應(yīng)器 微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式； 因?yàn)橹参锛?xì)胞生長周期長，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置； 由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置； 為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。 圖示：機(jī)械攪拌式反應(yīng)器圖示：機(jī)械攪拌式反應(yīng)器氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng) 消除機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用，同時(shí)避免攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸所帶來的污染。 但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻，不徹底。 圖示：氣壓攪拌式反應(yīng)器圖示：氣壓攪拌式反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng) 一般用于產(chǎn)品中試

52、或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。 成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系 必須滿足： 浮懸培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小， 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，外觀為大小均一的小顆粒。 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般2 3 天甚至更短時(shí)間便可增加 1 倍。 懸浮培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)增生長成 S 形曲線。（2）、固定化培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)： 可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調(diào)節(jié)； 由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，并可以從培養(yǎng)基 正不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)，有利于次生產(chǎn)物的合成。

53、細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類： 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 （3）器官培養(yǎng) 利用生物反應(yīng)器對(duì)植物的根、芽和胚狀體等器官進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定3、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的影響因素 內(nèi)因：外植體（種類、年齡、部位等） 外因：培養(yǎng)系統(tǒng)類型；培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分、酸堿度，含氧量，激素類型與比例）；培養(yǎng)環(huán)境（溫度光照）植物組培專題 一、褐化問題 1、褐化現(xiàn)象是指組織培養(yǎng)誘導(dǎo)脫分化或再分化的過程中，外植體組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)而使得培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體隨之褐變死亡的現(xiàn)象 ，又稱酚污染 。 2、褐化現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)過程中廣泛存在，已經(jīng)成為植物組織培養(yǎng)成功的主要影響因素之一。 3、一般認(rèn)為，褐化是由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌類物質(zhì)，抑制了相關(guān)酶的活性，從而阻礙培養(yǎng)材料的正常生長，甚至導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡。 4、影響外植體褐化的因素、影響外植體褐化的因素 4.1 外植體本身對(duì)褐化的影響外植體本身對(duì)褐化的影響 組織培養(yǎng)過程中，木本植物一般比草本植組織培養(yǎng)過程中，木本植物一般比草本植物易發(fā)生褐變。物易發(fā)生褐變。 在木本植物中，核桃、板栗由于單寧含量很高，進(jìn)行組織培養(yǎng)難度很大，不僅在接種后的初代培養(yǎng)期容易發(fā)生褐變，而且在形成愈傷組織以后也會(huì)