放線菌抗生素的發(fā)酵及其目的產物的提取實驗報告

1、*-放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產物的提取一、實驗目的1 、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養(yǎng)方法2 、了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術和方法3 、了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調控理論4 、了解小型發(fā)酵罐的基本結構5 、熟悉掌握小型發(fā)酵罐的使用方法和保養(yǎng)6.掌握抗生素生物效價測定的原理和方法；7. 掌握管碟法測定抗生素生物效價相關的操作方法。8.掌握放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的基本原理和操作技術二、實驗原理 發(fā)酵罐是進行液體發(fā)酵的特殊設備。生產上使用的發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實驗室使用的小型發(fā)酵罐，其容積可從約 lL 至數百升或稍大些。一般來說，5L 以下是用耐壓玻璃制作

2、罐體， 5L 以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動地調控試驗所需要的培養(yǎng)條件，是微生物學、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學研究所必需的設備。抗生素（ antibiotics）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物， 能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質?，F*-臨床常用的抗生素有轉基因工程菌 培養(yǎng)液液中提取物以及用化學方法合成或半合成的化合物 。放線菌發(fā)酵結束后， 次級代謝物可能與菌體結合， 工業(yè)上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理， 釋放與菌體結合的次級代謝物， 并采用加熱發(fā)酵液 70 ， 2 min 使

3、蛋白凝固，所得酸性濾液，在經堿處理，進一步去除蛋白?？股氐男r常采用微生物學方法測定， 它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法是根據抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴散滲透作用， 比較標準品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。 管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內徑 6.0 ±0.l mm ，外徑 8.0 ±0.l mm ，高 10±0. lmm ），管內放人標準品和檢品的溶液， 經 1618 小時恒溫培養(yǎng)， 當抗生

4、素在菌層培養(yǎng)基中擴散時， 會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度， 即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到或高于 MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現透明的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據擴散定律的推導，抗生素總量的對數值與抑菌圈直徑的平方成線性關系， 比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經列入藥典。二劑量法系將抗生素標準品和供試品各稀釋成一定濃度比*-例（ 2:1 或 4:1 ）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據抗生素濃度對數和抑菌圈直徑成直線關系的原理來計算供

5、試品效價。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個平板表面放置 4 個小鋼管，管內分別放入供試品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。先測量出四點的抑菌圈直徑，按下列公式計算出檢品的效價。（1）求出 W和 V： W=（SH+UH）- （SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）- （SH+SL）(式 2.10-2)式中： UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑；UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑；SH：標準品高劑量之抑菌圈直徑；SL：標準品低劑量之抑菌圈直徑；（2）求出：=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：供試品和標準品的效價比；D：標準品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1I：高

6、低劑量之比的對數，即log2或log4。求出Pr：Pr=Ar×( 式 2.10-4)式中： Pr：供試品實際單位數；Ar：供試品標示量或估計單位甲醛滴定法測定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結合 ,可形成羥甲基衍生物，使NH3+ 上的 H+游離出來，這樣就可*-用堿滴定 NH3+ 放出的 H+，從而計算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸， 由甲醛滴定的結果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質水解物），則滴定結果不能作為氨基酸的定量依據。甲醛滴定法常用于測定蛋白質的水解程度，隨著水解

7、程度的增加， 滴定值增加，當水解完全后，滴定值保持恒定。甲基紅的變色范圍是PH4.46.2, 意思是說 :1. 其 pH值在 4.46.2 區(qū)間時 , 呈橙色 ,2. 其 pH值 4.4 時, 呈紅色 , 因是靠近酸性強的一邊時的顏色 ,故又稱之為酸色。3. 其 pH值 6.2 時, 呈黃色，因是靠近堿性強的一邊時的顏色 ,故又稱之為堿色二、儀器與材料（一）培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0gNaCl 0.5g KNO3 1.0gK HPO 0.5gMgSO.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g244蒸餾水 1000ml ，PH 7.4 ，發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：淀粉 3%,葡萄糖

8、 2%, 黃豆餅粉 2.5%, 蛋白胨 0.5% ,酵母粉 0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%,KH 2PO4, 0.03%,CaCO3 0.4%, PH 6.0。黃豆餅粉4g, 淀粉 10g, 酵母粉 0.25 g , 蛋白胨 1.5g,*-MgSO4 0.025 g,CaCO3 0.4g,(NH4) 2SO4 0.3 g,-淀粉酶（ 105u/ml） 0.01ml.100mlPH7.4-7.6可溶性淀粉2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O0.05g， FeSO4.7H2O0.001g，加蒸餾水至 1

9、00ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨牛肉膏(5.0g），蛋白胨（ 10.0g）， NaCl（5g），蒸餾水（ 1000mL）， pH 7.27.4發(fā)酵罐培養(yǎng)基 (2L) ：黃豆餅粉80g淀粉200g酵母粉5 g蛋白胨30gMgSO40.5 gCaCO38g(NH4) 2SO46 g?- 淀粉酶（ 105u/ml ） 0.2ml（二 ) 流加補料碳源：葡萄糖（ 10%）300ml, 控制 1%；2000*1%=20g,200ml氮源：硫酸銨（ 10%）250ml, 控制 16%調 PH值： 0.1MHCl0.1MNaOH（三 ) 分析指標及方法所用試劑及溶液測殘?zhí)?-DNS法1. 3，5 二硝基

10、水楊酸試劑（ DNS 試劑）：將 6.3g 的 3，5 二硝基水楊酸和 2molNaOH 溶液加到 500ml 含有 182g 酒石酸鉀鈉的熱*-水溶液中，再加 5g 結晶苯酚和 5g 亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到 1000ml2. 1.0mg/ml 葡萄糖溶液：稱取 1g 葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。3. 6mol/l 氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉 24g,加蒸餾水定容到100ml。4. 6mol/l 的鹽酸：取濃鹽酸 49.68ml,加蒸餾水定容到 100ml。測殘氮的方法 - 甲醛法1. 甲基紅： 0.1g 甲基紅，用 95%乙醇定容 100ml。2. 0.3mol/LHCL：

11、取濃鹽酸 2.48ml,加蒸餾水定容到 100ml。3. 0.02858mol/L NaOH：稱 0.11432g, 定容 100ml。4. 1% 酚酞指示劑：稱取 1g 酚酞指示劑粉末。溶于 100ml 95%乙醇溶液中。5. 95% 乙醇：取乙醇 96ml, 倒入 100ml 容量瓶中定容值 100ml。6. 18% 中性甲醛：取 48ml 38%的甲醛加入小于 100ml 容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。（四）器材玻璃試管、 試管架、吸管（ 1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（ 250 ml，500ml）、量筒（ 250m

12、l，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺秤、 5L- 發(fā)酵罐，無菌室、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養(yǎng)室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、*-稱量管、毛細滴管、天平、直尺或游標卡尺、超凈工作臺，無菌培養(yǎng)皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等（五） . 生物效價測定所需材料（1）菌種：大腸桿菌（ Escherichia coli ），菌液濃度約為 106 個/mL。菌株保存的時間過久，影響其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時間后， 可以重新配制純化或

13、者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數。（ 2）抗生素標準品和供試品：頭孢拉定標準品和供試品。（ 3）培養(yǎng)基：效價檢定用培養(yǎng)基 1 號。（4）無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g ，磷酸二氫鉀 0.41g ，加水1000mL，即為 pH 7.8 的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應為分析純，配制后的緩沖液應澄清，分裝于玻璃容器內，經121蒸氣滅菌30 min 備用。（ 5）草酸， 10 M NaOH四、實驗步驟篩選高產放線菌從土壤里篩選出高產放線菌，于斜面培養(yǎng)基中保藏接種在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種針挖塊約20.5 ×1cm ，接種于滅過菌的高氏一號培養(yǎng)基中。培養(yǎng)*-將接種好的

14、種子搖瓶于28恒溫室搖床上，轉速為200r/min ，培養(yǎng) 48 小時左右。實罐滅菌1 、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐及補料瓶，易產生泡沫的培養(yǎng)基盡量不要超過兩升。2 、連接管路：取樣管路連接，補料管路連接；空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接， 并用彈簧夾夾緊； 排氣口與過濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、 pH 電極、溶氧電極， pH 電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。3 、提起玻璃罐體及補料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發(fā)酵溫度及時間。4 、滅菌結束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。發(fā)酵操作1

15、、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調整通氣量至 35L/min 。2 、將溫度電極、 pH電極、溶氧電極與控制器連接。3 、補料管連接：打開補料蠕動泵防護蓋，搬開進出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉動泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處， 開手動開關約十秒后夾緊出口處管夾， 關手動開關；將酒精棉球放在罐蓋補料口內，將針頭插入并穿透密封蓋；打開蠕動泵手動開關，使輸液管中充滿料液，置于自動狀態(tài)。*-接種將培養(yǎng) 48 小時的搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中， 使用接種圈放置酒精棉點燃，進行無菌接種，接入100ml 種子。接種后立即進行第一次取樣。發(fā)酵生產發(fā)

16、酵過程的測定：發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)發(fā)酵中殘?zhí)堑臏y定 -DNS法：1.取 1.0mg/ml 葡萄糖標準溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱 5min，冷水冷卻定容至25ml 搖勻，在 520nm 按波長測吸光度。編號葡萄糖標準溶液 /ml水 /ml溶液糖含量 /mgDNS 試劑 /ml00201.510.21.80.21.520.41.60.41.530.61.40.61.540.81.20.81.551.01.01.01.561.20.81.21.571.40.61.41.581.60.41.61.52.取發(fā)酵液 0.5ml 置于 50ml 容量瓶中，加 6mol/l 的鹽酸

17、溶液*-2ml，在沸水溶液中加熱 15min 水解，冷水冷卻后及時 6mol/l 氫氧化鈉溶液 1.8ml，并定容到 50ml 的總糖水解液。3.取總糖水解液 2ml 于 25ml 比色管中，加入 DNS 試劑 1.5ml 沸水浴中加熱 5min，冷水冷卻后定容至 25ml 搖勻，以空白作對照在 520nm 波長測吸光度。氨基酸氮的測定：甲醛法 ( 陳鈞鳴和徐玲娣 ,1991) 。取 2ml 發(fā)酵液濾液于三角瓶內 , 加蒸餾水 10ml, 甲基紅指示劑 2 滴, 用 O.3MHCI 調節(jié) pH至溶液呈紅色 , 再用 0.02858MNaOH溶液調 pH至溶液呈橙色( 中性 ), 加 18%中性

18、甲醛溶液 4ml, 搖勻 , 靜置 10min, 加 l%酚酞指示劑8 滴, 用 0.02858NNaOH標準溶液滴定至微紅色為終點。氨基氮的計算公式為 : 氨基氮 (mg/l00ml)= 滴定體積 *20。放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的1 、配制培養(yǎng)基高壓滅菌。2 、倒平板。3 、涂布指示菌。4 、以無菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。5 、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至 pH 1.4- 3.0 左右， 70 ， 2 min ， 以 10000 rpm 離心 20 min 。6 、取上清加入水稀釋 20%左右，在 4，用 10 M Na

19、OH中和至pH6.4- 6.8 。7、吸取中和液100 L 加入牛津杯中， 37培養(yǎng) 16hr ，觀察*-結果。效價測定1. 稱量稱量前，將抗生素標準品和供試品從冰箱取出， 使與室溫平衡，供試品應放于干燥器內至少 30 min 方可稱取。供試品與標準品應用同一天平；吸濕性較強的抗生素在稱量前 12 小時更換天平內干燥劑。標準品稱量不可少于 20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水稱樣量的計算 W=V*C/P ( 式 2.10-4)式中： W：需稱取標準品或供試品的重量（mg）V：溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（ mL）C ：標準品或供試品高劑量的濃度（

20、U/mL， g/mL）P ：標準品的純度或供試品的估計效價（ U/mg，g/mg）2. 稀釋從冰箱中取出的標準品溶液，必須先在室溫放置， 使其溫度達到室溫后，方可量取。標準品或供試品溶液的稀釋應采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過3 步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23 次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標準品與供試品用的緩沖液應同一批和同瓶，（預計不夠時，應事先與另一瓶混勻后再用） ，以免因 pH 或濃度不同影響*-預定結果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下， 再準確補加至刻度。 標準品與供試品高低濃度之比為 2:1 或 4:1 ，但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內。3. 雙碟制備在超凈工作臺上，用滅菌大口吸