人類角膜緣干細胞對外周血淋巴細胞作用的實驗研究(一)

1、人類角膜緣干細胞對外周血淋巴細胞作用的實驗研究(一)關(guān)鍵詞：人類角膜 【摘要】目的觀察體外培養(yǎng)的人類角膜緣干細胞對同種異體外周血淋巴細胞的作用。方法通過植片技術(shù)分離人角膜上皮細胞以及角膜緣干細胞。在兩種細胞單層上，觀察同種異體外周血淋巴細胞對絲裂原刀豆蛋白（ConA）的增殖反應(yīng)。另外，將兩種細胞培養(yǎng)上清直接轉(zhuǎn)移到由Con刺激的淋巴細胞增殖系統(tǒng)，以觀察兩種細胞釋放某些因子的抑制效應(yīng)。結(jié)果單層角膜緣干細胞對Con刺激的外周血淋巴細胞增殖反應(yīng)可以施加有效的抑制效應(yīng)。角膜緣干細胞培養(yǎng)上清對Con刺激的外周血淋巴細胞增殖系統(tǒng)，在72h分離上清顯示有明顯抑制效應(yīng)。結(jié)論角膜緣干細胞通過細胞交互作用和（或）釋

2、放某些抑制性因子對淋巴細胞的活化和增殖發(fā)揮潛在的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】角膜上皮細胞;角膜緣干細胞;細胞培養(yǎng) Studiesonthekeratolimbalstemcelltothepericirculationlymphocyteactivationandproliferation 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheregulationofhostlymphocyteactivationbytheallograftoflimbalstemcells.MethodsLimbalstemcellsandthecornealepithelialcellswere

3、culturedandisolatedfromhumancorneasbyexplanttechnique.Themediumsofeachcellsweregatheredtimeandwerefreezeatdifferenttimein-20afterpurification.LymphocytesoftheotherbodywereculturedinmediumsstimulatedbyConA.Limbalstemcellsorthecornealepithelialcellsofthehumanwereco-culturedwiththelymphocytesfromtheoth

4、erbodysblood.LymphocyteproliferationassaywasassessedbyMTTcolorimetricdetermination.ResultsSignificantproliferationofthelymphocyteswasshownafteraddingtheConA.Thegatheredsupernatantofthe72heitherfromthelimbalstemcellsorthecornealepithelialcellswasshownapotentinhibitoryeffectofthelymphocytesproliferati

5、on.Themonolayerdomesticrabbitslimbalstemcells,showedasignificantsuppressiveeffectontheallograftlymphocytesproliferationaftermixedlymphocyteculturefor48h,butthisphenomenoncouldntbeseeninthemonolayercornealepitheliuminvitro.ConclusionTheresultsshowthattherewouldbealotofpossiblemechanismsthatworkedinde

6、pendentlyorworkedinconcerttoinhibitthelymphocytesproliferation,butmainlybycell-cellinteractionand/orsomeothersolublefactors,andlimbalstemcellswouldtakearoleonraisingtheeyeimmunity. 【Keywords】cornealepithelium;limbalstemcell;cellculture 在比較聯(lián)合角膜緣的穿透性角膜移植與單純大植片角膜移植的術(shù)后植片存活率的比較時發(fā)現(xiàn)，前者的排斥反應(yīng)發(fā)生率低1，2，其機制尚未見研究

7、報道，是否因為角膜緣干細胞有抑制淋巴細胞生長的功能，亦尚無此方面研究報道，我們前期的實驗證實兔角膜緣干細胞可通過細胞交互作用和（或）釋放某些抑制性因子抑制同種異體兔淋巴細胞的活化和增殖3。本實驗旨在觀察人類同種異體角膜緣干細胞對宿主淋巴細胞活化和增殖的調(diào)節(jié)效應(yīng)，并進一步從實驗室體外培養(yǎng)角度證實角膜緣干細胞與角膜上皮細胞相比在引起同種異體排斥反應(yīng)中的作用。 1材料與方法 1.1人角膜緣干細胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備在無菌條件下取新鮮人角膜，將角膜分為中央和角膜緣組織，去除角膜內(nèi)皮細胞以及后2/3角膜板層后，將組織切成1mm2mm，上皮細胞面向下置于12孔培養(yǎng)板中，每孔有3塊組織。加入少量完全細胞

8、培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1ml雙抗），切勿使組織塊漂浮。在37體積分數(shù)為5%CO2和95%空氣條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基每1天更換1次，6天去除接種組織塊。當(dāng)細胞形成單層達70%以上時，用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA液（12）消化傳代。在12孔板選擇生長良好匯合的傳代細胞。在12h內(nèi)使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基換液3次以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，每孔加入新鮮無血清培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)，每24h收集上清1次，共收集5次。2000/min離心10min，取上清液，去除細胞碎屑，加入1g/L質(zhì)量濃度牛血清白蛋白（FBS）。使用3.47m分子截流量透析袋透析濃縮2

9、5倍，-20凍存。 1.2ConA誘導(dǎo)的同種異體人外周血淋巴細胞的增殖取同種異體人外周血3ml，先用PBS液等量稀釋，在緩慢加入3ml的淋巴細胞分離液（上海第一生物制品所研制）。20密度梯度離心（2000/min20min）后，取出分離好的單核細胞層，用PBS沖洗2次后，加入4ml完全培養(yǎng)基，打勻細胞后，計數(shù)。調(diào)整細胞濃度至5109個/L，使用96孔培養(yǎng)板，每孔加細胞100l，并分別加入各個時間段所取的角膜上皮細胞或角膜緣干細胞的條件培養(yǎng)基50l，各作6個復(fù)孔。設(shè)立各組的平行對照組，每孔加入ConA（concanavalinA，C2631,Sigma）至終濃度為2.5mg/L。5ml/LCO2

10、，37培養(yǎng)48h。用四甲基偶氮唑鹽比色分析法（MTT法）4測定所誘導(dǎo)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化：各孔加入MTT（5mg/ml）20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，低溫密度梯度離心（4，3000/min離心10min），小心吸出全部上清，采用MTT法，每孔加入MTT溶解液100l，微量振蕩器震蕩30min，使MTT還原產(chǎn)物甲月替（formazan）完全溶解。酶標(biāo)儀測定540nm光密度值（OD）。 1.3混合淋巴細胞反應(yīng)（mixedlymphocytereaction,MLR）5分別將人角膜上皮細胞以及角膜緣干細胞（反應(yīng)細胞）和同種異體人外周血淋巴細胞（刺激細胞），等量細胞濃度（0.5109個/L）混合。使用96孔板，每孔

11、加反應(yīng)細胞和刺激細胞各100l。37孵育48h，用MTT比色分析法測定所誘導(dǎo)的淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值。 1.4統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件，將各組所測的OD值進行單因素方差分析，比較組間差異。P0.05為差異有顯著性，P0.01為差異有極顯著性。 2結(jié)果 2.1人角膜緣干細胞對絲裂原激活同種異體外周血淋巴細胞的抑制作用在ConA存在下，人外周血淋巴細胞發(fā)生顯著的增殖效應(yīng)。但將ConA加人外周血淋巴細胞在同種異體角膜緣干細胞及角膜上皮細胞培養(yǎng)的不同時間段的條件培養(yǎng)基中共育時，72h收集的不論是角膜緣干細胞或是角膜上皮細胞的條件培養(yǎng)基均對外周血淋巴細胞的增殖有顯著性抑制作用（P0.01）

12、（見圖1）。 2.2與人角膜緣干細胞共育對同種異體外周血淋巴細胞活性的影響分別將角膜緣干細胞、角膜上皮細胞與等量的同種異體外周血淋巴細胞共育48h，角膜緣干細胞顯著減弱同種異體人外周血淋巴細胞增殖反應(yīng)（P0.01）（見圖2）。 2.3角膜上皮細胞對外周血淋巴細胞活性的影響在角膜上皮細胞存在時，同種異體人外周血淋巴細胞活性未見明顯受抑制，但角膜上皮細胞培養(yǎng)的72h上清對外周血淋巴細胞有顯著抑制效應(yīng)（見圖1、2）。圖1淋巴細胞與角膜上皮細胞及角膜緣圖2角膜緣干細胞以及角膜上皮細胞與淋巴細胞混合培養(yǎng) 2.4角膜緣干細胞原代培養(yǎng)與角膜上皮細胞原代培養(yǎng)相比，角膜緣干細胞增殖能力明顯強于角膜上皮細胞，培養(yǎng)

13、第3天，可見大量正在分裂的細胞（見圖3），培養(yǎng)第7天角膜緣干細胞增生分化出的上皮細胞已呈片狀布滿整個培養(yǎng)孔。圖3角膜緣干細胞原代培養(yǎng) 3討論 綜合所述，可以得到以下推論：（1）角膜上皮細胞分泌的細胞因子有抑制同種異體外周血淋巴細胞的作用，但是將單層角膜上皮與外周血淋巴細胞共育以上作用就顯著下降；（2）角膜緣干細胞可分泌抑制同種異體外周血淋巴細胞的細胞因子，并且在形成角膜緣干細胞單層后，這種對同種異體外周血淋巴細胞的抑制作用更強；（3）角膜緣干細胞或角膜上皮細胞體外培養(yǎng)，在72h產(chǎn)生相應(yīng)的細胞因子對抑制外周血淋巴細胞增殖作用最顯著。 以上推論提示：角膜緣干細胞除了具有在角膜移植術(shù)后提供角膜上皮生

14、長源泉從而降低排斥發(fā)生的作用外，還可能通過下述2條途徑來實現(xiàn)其抑制免疫排斥反應(yīng)的作用：（1）釋放可溶性細胞因子；（2）通過細胞膜相關(guān)的抑制因子或細胞通訊。已證實在培養(yǎng)狀態(tài)下角膜緣干細胞可表達IGF-1(insulin-likegrowthfactortype1)、TGF-1、TGF-2、LIF（leukemiainhibitoryfactor）、bFGF及其相關(guān)受體6。目前已研究發(fā)現(xiàn)在治療由于干細胞缺乏所致的眼表疾病中，角膜緣干細胞移植術(shù)明顯提高了單純行部分穿透角膜移植的手術(shù)成功率。這一現(xiàn)象表明了干細胞對維持角膜處于相對免疫赦免狀態(tài)起著重要作用7，8。但是目前尚未見對角膜緣干細胞免疫原性的研究

15、報道，并已證實角膜緣干細胞具有屏障功能，可顯著阻礙新生血管的長入9，但是角膜緣干細胞是否具有阻礙外周血淋巴細胞進入的功能尚未得到證實。 我們的研究表明，角膜緣干細胞可能通過釋放可溶性細胞因子以及細胞間通訊來有效地阻礙同種異體外周血淋巴細胞進入的功能。該作用尚未見其他研究報道證實。角膜緣干細胞移植是否通過阻礙同種異體外周血淋巴細胞進入而提高高危移植的成功率尚需進一步的實驗及臨床研究?！緟⒖嘉墨I】 1洪榮照,吳護平,王印其,等.角膜緣移植聯(lián)合穿透性角膜移植的臨床觀察.眼科,1998,7(4):224. 2龔向明,劉紅山,鐘興武,等.角膜緣上皮移植聯(lián)合角膜移植治療眼化學(xué)燒傷.中國實用眼科雜志,199

16、8,16(8):472. 3鄧宏偉，李辰，陳建蘇,等.角膜緣干細胞對外周血淋巴細胞活化和增殖作用的實驗研究.眼科研究,2003，21（3）：261-263. 4MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunologicalMethods,1983,65:55. 5ColiganJE,KruisbeekAM,MargululiesDH,etal.Currentprotocolsinimmunology.NewYork

17、:GreenePublishinGandWileyInterScience,1991,3-12. 6LiDQ,TsengSCG.Threepatternsofcytokineexpressionpotentiallyinvolvedinepithelial-fibroblastinteractionsofhumanocularsurface.JCellPhysiol,1995,163:61. 7HollandEJ,DjalilianAR,SchwartzGS.Managementofaniridickeratopathywithkeratolimbalallograft:alimbalstemcelltransplantationtechnique.Ophthalmology,2003,110(1):125-130. 8