人B 淋巴細(xì)胞刺激因子體外活性分析(一)

1、人B 淋巴細(xì)胞刺激因子體外活性分析(一)    【摘要】 目的: 分別采用MTT和ATPLiteTMM發(fā)光法分析人B細(xì)胞刺激因子對(duì)培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞的生物學(xué)活性。方法: 分離小鼠脾細(xì)胞, 培養(yǎng)72 h后, MTT和ATP方法測(cè)定不同密度脾細(xì)胞的增殖, 從中選定適當(dāng)?shù)钠⒓?xì)胞密度分析BLyS活性。然后, 檢測(cè)不同劑量的BLyS對(duì)脾細(xì)胞的刺激作用。結(jié)果: 用MTT和ATPLiteTMM發(fā)光法分析發(fā)現(xiàn): BLyS在1、 5、 10和20 mg/L時(shí), 都能明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖。結(jié)論: MTT法檢測(cè)BLyS對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用是一種簡(jiǎn)單、 快捷的方法。利用這種

2、細(xì)胞模型, 可以對(duì)BLyS拮抗劑進(jìn)行初步篩選以期獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的治療劑。 【關(guān)鍵詞】 B細(xì)胞刺激因子 自身免疫性疾病 ATPLiteTM B細(xì)胞 MTTB淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是TNF 家族中的一員1, 又稱為B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)2, 由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞持續(xù)合成、 分泌。BLyS以膜結(jié)合和可溶性兩種形式存在。膜結(jié)合型BLyS由285個(gè)氨基酸組成, 經(jīng)蛋白酶水解膜外區(qū)的133134氨基酸殘基肽鏈后, 可產(chǎn)生由152個(gè)氨基

3、酸組成的可溶性活性多肽可溶性BLyS(soluble BLyS, sBLyS), 進(jìn)入血液循環(huán)。在體內(nèi)、 外, sBLyS均具有特異地刺激B細(xì)胞的作用, 是B細(xì)胞發(fā)育、 存活所必需的3。而過(guò)量表達(dá)BLyS與某些自身免疫性疾病, 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)和口眼干燥綜合征(Sjogren syndrome, SS)等有關(guān)4。在這些疾病患者血清中, BLyS水平也明顯升高5, 6。目前, BLyS拮抗劑治療SLE和RA正處在臨床試驗(yàn)階段, 有望成為治療SLE和RA的新方

4、法。本研究中采用MTT和ATPLiteTMM發(fā)光法, 探討了人BLyS對(duì)小鼠脾細(xì)胞的作用。這將為進(jìn)一步尋找潛在BLyS的拮抗劑提供了初步篩選的簡(jiǎn)捷方法。1 材料和方法1.1 材料 BALB/c小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供?？扇苄訠LyS(sBLyS)的原核表達(dá)載體及其空白質(zhì)粒pET30a, E.coli BL21菌株由本室保存。鎳螯合瓊脂糖凝膠購(gòu)自北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司。sBLyS的表達(dá)、 純化參照文獻(xiàn)7報(bào)道。ATPLiteTMM發(fā)光法試劑盒購(gòu)自PerkinElmer life sciences公司。1.2 方法1.2.1 小鼠脾細(xì)胞的制備 取46周齡的小鼠, 脫臼處死后, 泡于

5、750 mL/L乙醇中消毒。取出小鼠, 放置平板上呈俯臥位。用鑷子夾起左側(cè)皮毛部, 剪開(kāi)皮膚、 腹膜, 分離脾臟, 放置平皿中。輕柔剪去脾臟兩側(cè)系膜及周圍組織, 于平皿中加入12 mL生理鹽水, 輕搖平皿洗滌。用平扁齒鑷子輕擠壓脾臟包膜, 將脾臟細(xì)胞擠至平皿中, 形成細(xì)胞懸液。預(yù)先于10 mL試管中加入3 mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液, 再沿管壁緩緩加入6 mL細(xì)胞懸液,形成不同的液面層。2000 r/min室溫離心30 min。輕輕環(huán)繞吸取界面細(xì)胞, 加入生理鹽水68 mL, 混勻、 洗滌。1500 r/min離心5 min。棄上清, 所得沉淀即為脾細(xì)胞。1.2.2 不同密度脾細(xì)胞增殖的分析 調(diào)整

6、脾細(xì)胞密度為1×109、 2.5×109、 5×109、 1×1010和2× 1010細(xì)胞/L, 96孔板每孔分別加入100 L, 于37、 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)72 h。MTT法分析時(shí), 在培養(yǎng)終止前6 h, 加入5 g/L MTT 10 L, 繼續(xù)培養(yǎng)至72 h, 每孔加入100 L 100 g/L酸化SDS裂解細(xì)胞, 于酶標(biāo)儀ELISAreader讀取A570值。ATPLiteTMM發(fā)光法參照生產(chǎn)商說(shuō)明書操作。每孔加入50 L細(xì)胞裂解液, 輕輕振搖5 min; 再每孔加入50 L底物溶液, 輕輕振搖5 min。光信號(hào)以每分鐘計(jì)

7、數(shù)(counts per second, CPS)為單位, 于Wallace 1420 multilabel counter VICTOR3(PerkinElmer, Singapore)儀測(cè)量。1.2.3 BLyS對(duì)脾細(xì)胞作用的分析 每孔加入固定密度的脾細(xì)胞。再分別加入不同濃度的BLyS。以pET30a空載體表達(dá)的74個(gè)氨基酸組成肽作為對(duì)照。于37、 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)72 h。同1.2.2, MTT和ATPLiteTMM發(fā)光法測(cè)細(xì)胞增殖。刺激指數(shù)(Stimulating index, SI)分別按以下公式計(jì)算: MTT法SI=(實(shí)驗(yàn)組A570細(xì)胞本底A570)/細(xì)胞本底A57

8、0; ATPLiteTMM發(fā)光法SI=(實(shí)驗(yàn)組CPS細(xì)胞本底CPS)/細(xì)胞本底CPS。2 結(jié)果2.1 脾細(xì)胞增殖曲線 測(cè)定了不同密度小鼠脾細(xì)胞的增殖, 以確定分析BLyS活性的適當(dāng)細(xì)胞密度（圖1、 2）。選取5×109細(xì)胞/L用作MTT法檢測(cè)BLyS活性的脾細(xì)胞密度; 3×109細(xì)胞/L用作ATPLiteTMM發(fā)光法檢測(cè)BLyS活性的脾細(xì)胞密度。圖1 MTT法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞的增殖 （略）圖2 ATPLiteTMM發(fā)光法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞的增殖（略）2.2 BLyS具有刺激脾細(xì)胞增殖的活性 BLyS基因片段的表達(dá)產(chǎn)物帶有來(lái)源于pET30a載體的56個(gè)氨基酸, 相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)

9、大約26000。因此, 我們純化了pET30a空載體表達(dá)的74個(gè)氨基酸組成的多肽, p30作為對(duì)照。純化的p30 Mr大約10000（圖 3）。圖3 純化人重組BLyS蛋白和對(duì)照肽, p30的電泳圖（略）M: 蛋白marker; 1: 對(duì)照肽p30; 2: sBLyS.每孔細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的sBLyS, 培養(yǎng)72 h, MTT法觀察BLyS對(duì)脾細(xì)胞的刺激作用。BLyS在濃度為1、 5、 10 和20 mg/L時(shí), 與對(duì)照相比, 能夠明顯刺激脾細(xì)胞增殖(P0.05, 圖4)。 同樣, ATPLiteTMM發(fā)光法分析顯示: BLyS在5、 10和20 mg/L時(shí)明顯刺激脾細(xì)胞增殖(P值分別

10、為0.007812, 0.000346和0.01955) (圖5)。圖4 MTT法檢測(cè)BLyS對(duì)小鼠脾細(xì)胞的活性圖5 ATPLiteTM法分析BLyS的活性（略）3 討論本研究中, 我們用MTT法和ATPLiteTMM發(fā)光法分析了人BLyS對(duì)培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞的作用。我們的結(jié)果顯示ATPLiteTMM法比MTT法稍敏感、 快捷。但ATPLiteTMM法缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的儀器和花費(fèi)高。Batten等用流式細(xì)胞術(shù)分析了人BLyS促小鼠脾細(xì)胞存活的作用8。同樣, 這種方法也需要復(fù)雜的儀器。MTT法相對(duì)簡(jiǎn)單, 也可以取得ATPLiteTMM法相似的結(jié)果。我們采用MTT法分析了自行設(shè)計(jì)的一種BLyS拮抗肽的作

11、用9。因此, 利用這種小鼠脾細(xì)胞模型, 可以對(duì)潛在BLyS拮抗劑進(jìn)行初步篩選, 以期獲得具有臨床應(yīng)用價(jià)值的治療劑?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Moore PA, Belvedere O, Orr A, et al. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulatorJ. Science, 1999, 286(5425): 260-263.2 Schneider P, MacKay F, Steiner V, et al. BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis

12、 factor family, stimulates B cell growthJ. J Exp Med, 1999, 189(11): 1747-1756.3 孫 劍. B淋巴細(xì)胞刺激因子J. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2003, 25(2): 85-87.4 孫 劍, 沈倍奮. B淋巴細(xì)胞因子與自身免疫性疾病J. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2003, 19(11): 804-806.5 Cheema GS, Roschke V, Hilbert DM, et al. Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with systemi

13、c immunebased rheumatic diseasesJ. Arthrit Rheum, 2001, 44(6): 1313-1319.6 Groom J, Kalled SL, Cutler AH, et al. Association of BAFF/BLyS overexpression and altered B cell differentiation with Sjogrens syndromeJ. J Clin Invest, 2002, 109(1): 59-68.7 孫 劍, 黎 燕, 馮建男, 等. 人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子的克隆及在大腸桿菌中表達(dá)J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2006, 22(2): 171-173.8 Batten M, Groom J, Cachero TG, et al. BAFF mediates survival of peripheral immature B lymphocytesJ. J