用冰凍兔血漿作血漿凝固酶試驗(yàn)的探討

1、實(shí)驗(yàn)技術(shù)用冰凍兔血漿作血漿凝固酶試驗(yàn)的探討于 梅 徐景野 傅小紅 張思敏中圖分類號:R446 5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:1007 0931(2001 06 0062 02作者單位:寧波市生防疫站, 寧波 315010血漿凝固酥試驗(yàn)陽性的金黃色葡萄球菌一般認(rèn)為其致病性較強(qiáng)1。血漿凝固酶試驗(yàn)常以兔血漿作為凝固物質(zhì), 一些學(xué)者認(rèn)為, 做金黃色葡萄球菌凝固酶用的血漿不宜冰凍。但基層實(shí)驗(yàn)室由于種種條件限制, 飼養(yǎng)動物有一定的困難, 致使新鮮兔血漿的來源受到限制。為此, 我們以兔血制成血漿后冰凍保存, 與新鮮兔血漿作比較, 并進(jìn)行效期觀察, 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。材料與方法1 血漿制備1 1 兔血漿制備:

2、無菌采取兔心臟血, 以1份滅菌的3 8%枸櫞酸鈉液抗凝劑加4份兔血的比例充分混勻, 離心, 吸取上清液即為原兔血漿, 分裝成1ml/支或0 5ml/支; 另用滅菌生理鹽水稀釋兔血漿, 制成4倍稀釋血漿(以下簡稱為稀釋兔血漿 , 分裝同上, 于 18 以下冰凍保存, 供試驗(yàn)用。1 2 人血漿制備:無菌采取人靜脈血, 抗凝方法同上, 離心制成新鮮人血漿, 用時1 4稀釋。2 試驗(yàn)菌株 從食品、食物中毒、醫(yī)院物體表面分離到的金黃色葡萄球菌168株,金黃色葡萄球菌參考株(AT CC25923 1株, 大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌各12株及未定型細(xì)菌26株、共255株。3 檢測

3、方法 血漿凝固酶試驗(yàn)方法參照中華人民共和國國有標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行2, 冰凍保存原兔血漿和稀釋兔血漿當(dāng)月隔天檢測一次, 一個月后每周檢測一次, 與新鮮兔血漿、人血漿作比較, 觀察凝固時間、凝固強(qiáng)度。結(jié) 果1 與新鮮兔血漿比較 冰凍的原兔血漿和稀釋兔血漿按國標(biāo)方法進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn), 以新鮮兔血漿為對照, 結(jié)果兩種兔血漿在12個月內(nèi)均能與不同來源的金黃色葡萄球菌和參考標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生凝固反應(yīng), 凝固時間為2 4小時, 其凝固強(qiáng)度與作比較的新鮮兔血漿一致, 符合率達(dá)到100%。保存12個月后冰凍的稀釋血漿凝固時間逐漸延長, 凝固強(qiáng)度逐漸減弱, 而冰凍原血漿到18個月以后才出現(xiàn)這種情況。2 交叉反應(yīng) 兩種濃度冰凍

4、保存的兔血漿與大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和未定型細(xì)菌作試驗(yàn), 結(jié)果均未發(fā)生凝固反應(yīng), 也未與同屬的表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌發(fā)生陽性反應(yīng)。3 特異性測定 168株金黃色葡萄球菌中, 有一株菌株兩種兔血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽性, 而人血漿呈陰性反應(yīng)。其余菌株反應(yīng)結(jié)果一致, 符合率達(dá)99 4%。討 論金黃色葡萄球菌是常見的化膿性疾病和食物中毒病原菌, 分布廣泛, 腸毒素是該菌主要致病因子, 目前國內(nèi)一般實(shí)驗(yàn)室開展金黃色葡萄球菌腸毒素測定的不多。血漿凝固酶與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān), 在通常情況下產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌大多數(shù)血漿凝固酶陽性, 因此血漿凝固酶試驗(yàn)是確定金

5、黃色葡萄球菌必不可少的試驗(yàn), 尤其是國內(nèi)常以此項(xiàng)試驗(yàn)作為判斷致病性金黃色葡萄球菌的主要依據(jù)?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中規(guī)定用新鮮兔血漿作為凝固物質(zhì), 新鮮兔血漿一般僅能用一周, 這對基層實(shí)驗(yàn)室來說, 要不定期地獲取新鮮兔血漿尚有一定的困難。我們參照國外凍干的兔血漿可保存冰箱中長期使用, 其凝固效果同新鮮兔血漿的報道3。根據(jù)國內(nèi)實(shí)際情況, 將兔血漿貯藏在 18 冰箱中, 作冰凍環(huán)境的保存期限觀察, 為方便使用對稀釋兔血漿也作了相同的觀察。結(jié)果稀釋兔血漿在冰凍中保存12個月, 其凝固程度同新鮮兔血漿, 而冰凍原兔血漿保存效限則更長, 實(shí)驗(yàn)證實(shí)在這段時間內(nèi)使用冰凍兔血漿的結(jié)果是可靠的, 說明冰凍兔血漿能

6、替代新鮮兔血漿, 這既極大地方便基層實(shí)驗(yàn)室對該項(xiàng)目的檢測, 又提高了兔血漿的使用率。若能嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程, 抽取一次兔血漿可使用二年以上, 節(jié)約了成本, 為廣大基層實(shí)驗(yàn)室所能普遍接受。檢測發(fā)現(xiàn), 解凍后的兔血漿以一次用完為宜, 否則會導(dǎo)致試驗(yàn)的失敗。作血漿凝固酶試驗(yàn)在兔血漿來源困難時, 一般會用人血漿代替, 但使用人血漿作血漿凝固酶試驗(yàn)時可發(fā)生假陰性4。究其原因, 可能是金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界, 與人類接觸機(jī)會較多, 存在著凝固酶抗體; 其次, 由于 球蛋白的存在, 致使凝固酶受到一定程度的抑制; 此外, Ehrenkranz 等證明5, 人血清中有抑制葡萄球菌的物質(zhì)。因此我們認(rèn)為

7、作為凝固物質(zhì)兔血漿優(yōu)于人血漿, ,漿凝固酶試驗(yàn)首選凝固物質(zhì)。參考文獻(xiàn)1 Cow an, S. T. T he classification of staphylocoui by preciptation andbiological reacti ons. J. Palhol Bacteriol, 1983, 6:312 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法. 微生物學(xué)部分,GB4789. 10. 943 Difco supplementary literature. Detroil Difco Laboratories, 1990,564 孟昭赫主編. 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法注解. 微生物學(xué)部

8、分. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1990, 1055 Ehrenkranz. N. J. el at. Serum bactei astasis of staphylococcus.Infect Inimun, 1971, 8:664(收稿日期:2000 12 13頂空氣相色譜法測定水中乙酸乙酯王惠華中圖分類號:R123 1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:1007 0931(2001 06 0063 02作者單位:浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江杭州 310009乙酸乙酯(沸點(diǎn)77 1 , 無色可燃性液體, 易著火,微溶于水。工業(yè)上常用作清漆稀釋劑、人造革、硝酸纖維素、塑料等的溶劑。工業(yè)過程中管道的破

9、裂、廢水的排放常使水體產(chǎn)生污染。水中乙酸乙酯的測定, 作者未見有關(guān)文獻(xiàn)報道。本文采用頂空氣相色譜法測定污染水源水中的乙酸乙酯, 具有操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn), 現(xiàn)報告如下。材料與方法1 儀器 日本島津GC 16A 氣相色譜儀, 氫火焰檢測器, 100 l 微量注射器, 135ml 頂空汽化瓶。2 試劑 乙酸乙酯(色譜純 , 色譜固定相GDX 102, 無甲醇乙醇。3 色譜條件 色譜柱4mm 2m 玻璃柱; G DX 102(60 80目 ; 柱溫:160 ; 檢測器溫度:180 ; 汽化室溫度190 ; 載氣流量:40ml/min; 氫氣流量:50ml/min; 空氣流量:500ml/min

10、。4 樣品測定 取樣品70ml (濃度高的樣品適當(dāng)稀釋 置于135ml 頂空瓶中, 立即加蓋密閉, 在恒溫水浴中(75 1 保持40min, 取1ml 液上氣進(jìn)樣, 記錄峰高。5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取800mg 乙酸乙酯, 以少量水洗入100ml 容量瓶中, 并加水稀釋至刻度, 吸取10 0ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液于100ml 容量瓶中, 加入無甲醇乙醇(控制乙醇含量在60% , 并加水稀釋至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)濃度為0 08g/100ml, 分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液25、50、75、100和150 l 于100ml 容量瓶中, 稀釋至100ml, 后取70ml 至130ml 頂空瓶中, 在恒溫水浴(75 1 中

11、保持40min, 取1ml 液上氣進(jìn)樣以峰高定量。6 計算方法X=F I C 稀釋倍數(shù)F S X 乙酸乙酯含量(g/100ml F I 樣品峰高或面積F S 標(biāo)準(zhǔn)峰高或面積C 標(biāo)準(zhǔn)濃度(mg /100ml結(jié)果與討論1 色譜分離 本法色譜條件可分離測定水中乙酸乙酯含量, 色譜分離圖(見圖1 , 乙酸乙酯保留時間為4 07min 。圖1 乙酸乙酯色譜分離圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 經(jīng)實(shí)驗(yàn), 在濃度0 02mg /100ml 0 12mg /100ml 內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0 9926, 表明在該范圍內(nèi)線性良好。3 不同汽化溫度與汽化時間的選擇 在液上頂空氣相色譜分析中, 待測組分的氣相色譜響應(yīng)值受不同的汽化溫度與表1 水中乙酸乙酯的回收率試驗(yàn)樣品本底測定(mg/100ml加入標(biāo)準(zhǔn)后樣品實(shí)